Pacritinib(SB1518)_生物活性和实验方法

发布时间:2018-10-20 21:55:59 编辑作者:活性小子

Pacritinib图片

图片:Pacritinib结构式

Pacritinib 是一种有效的野生型 JAK2 和 JAK2V617F 突变型抑制剂,IC50 分别为 23 nM 和 19 nM。Pacritinib 也抑制 FLT3及其突变型FLT3D835Y,IC50 分别为 22 nM 和 6 nM。

一、Pacritinib的生物活性:
1)体外活性
相对于JAK2,Pacritinib(SB1518)对TYK2的效力低两倍(IC50 = 50 nM),对JAK3的效力低23倍(IC50 = 520 nM),对JAK1的效力低56倍(IC50 = 1280 nM) 。其余评价的激酶在相当于其米氏常数(Km)的三磷酸腺苷浓度下针对100nM Pacritinib进行测试时显示<30%的抑制。 Pacritinib抑制MV4-11和MOLM-13细胞(两者都是源自由FLT3 ITD突变驱动的人急性髓性白血病的细胞系),IC50分别为47和67nM。 Pacritinib抑制Karpas 1106P和Ba / F3-JAK2V617F细胞(它们是依赖于JAK2信号传导的细胞系),IC50分别为348和160 nM [1]。将含有MV4-11细胞的FLT3-ITD用不同浓度的Pacritinib(SB1518)和pFLT3处理3小时,定量pSTAT5和pERK1 / 2水平。 Pacritinib导致pFLT3,pSTAT5,pERK1 / 2和pAkt的剂量依赖性降低,IC50分别为80,40,33和29nM。与MV4-11和MOLM-13细胞中的FLT3-ITD相比,RS4; 11中FLT3-wt的自磷酸化IC50高4倍(IC50 = 600nM)。然而,在低得多的Pacritinib浓度下检测到STAT5抑制作用(IC50 = 8 nM)[2]。

Pacritinib是野生型JAK2和JAK2V617F突变体的有效抑制剂(IC50:19 nM)。 Pacritinib的IC50对于TYK2为50nM,对于JAK3为520nM,对于JAK1为1280nM。 Pacritinib有效地渗透细胞以调节JAK2下游的信号传导途径,无论是激动剂激活还是突变激活。 Pacritinib在JAK2WT-和JAK2V617F依赖性细胞中诱导细胞凋亡,细胞周期停滞和抗增殖作用。 Pacritinib分别抑制Karpas 1106P(IC50:348nM)和Ba / F3-JAK2V617F(IC50:160nM)的细胞增殖。 Pacritinib分别抑制来自红细胞(IC50:63 nM)和骨髓祖细胞(IC50:53 nM)的内源性集落生长[1]。 SB1518还抑制FLT3及其突变体FLT3-D835Y(IC50:6nM)。 Pacritinib在FLT3-内部串联重复(ITD),FLT3-wt细胞和原代AML胚细胞中抑制FLT3磷酸化和下游STAT,MAPK和PI3K信号传导。 Pacritinib治疗导致携带MV4-11细胞的FLT3-ITD中pFLT3,pSTAT5,pERK1 / 2和pAkt的剂量依赖性降低,IC50分别为80,40,33和29nM。用Pacritinib处理原代AML胚细胞3小时导致pFLT3,pSTAT3和pSTAT5的剂量依赖性降低,IC50低于0.5μM。 Pacritinib在FLT3突变体和FLT3-wt细胞中诱导细胞凋亡,细胞周期停滞和抗增殖作用。 Pacritinib抑制携带FLT3-ITD的细胞MV4-11(IC50:47nM)和原代AML blast(IC50:0.19-1.3nM)细胞的细胞增殖。

2)体内活性
为了评估Ba / F3-JAK2V617F植入模型中的功效,用口服50或150mg / kg剂量的Pacritinib(SB1518)处理小鼠。 q.d.在细胞接种后4天开始药物给药13天。在研究终止时,载体对照小鼠表现出脾肿大和肝肿大(分别为约7倍和1.3倍),使人联想到症状性骨髓纤维化患者的症状。 SB1518治疗150 mg / kg p.o. q.d.显着改善所有这些症状,脾脏重量正常化60%(±9%),肝脏重量正常化92%(±5%),耐受性良好,无明显体重减轻或任何血液学毒性,包括血小板减少和贫血[1] 。在大鼠中,Pacritinib(SB1518)显示出适度快速吸收(tmax = 4 h),峰值浓度为114 ng / mL,AUC为599 ng•h / mL,单次终末半衰期为6 h口服剂量为10毫克/千克。在狗中,Pacritinib(SB1518)被迅速吸收(tmax = 2.0 h),峰值浓度为~12 ng / mL,AUC为53 ng•h / mL,单次口服后终末半衰期为3.4 h剂量为3毫克/千克[3]。

在JAK2V617F依赖性异种移植模型中,Pacritinib(150 mg / kg,po,qd)显着改善脾肿大和肝肿大症状,脾脏重量正常化60%,肝脏重量正常化92%,耐受性良好,无明显体重减轻或任何血液学 毒性,包括血小板减少和贫血。 在JAK2V617F依赖的SET-2异种移植模型中,Pacritinib剂量依赖性抑制肿瘤生长(75mg / kg为40%,150mg / kg为61%)[1]。 Pacritinib每日一次治疗连续21天,诱导肿瘤生长的剂量依赖性抑制(25mg / kg为38%,50mg / kg为92%,100mg / kg为121%)。 对于50和100mg / kg /天组,分别在3/10和8/8小鼠中观察到完全消退。

二、Pacritinib的实验方法:
1)细胞实验
使用SET-2和Karpas 1106P细胞,以及Ba / F3-JAK2V617F-GFP-Luc细胞。 对于96孔板中的增殖测定,将细胞以30-50%汇合接种,并在第二天用化合物(例如Pacritinib)(一式三份)以高达10μM的浓度处理48小时。 使用CellTiter-Glo测定监测细胞活力。 绘制剂量 - 反应曲线以使用XL-fit软件确定化合物的IC 50值[1]。

2)动物实验
2.1)小鼠[1]
使用12周龄的雌性无胸腺BALB / c裸鼠(BALB / cOlaHsd-Foxn1nu);使用9-10周龄的雌性SCID米色小鼠(CB17.Cg-PrkdcscidLystbg / Crl)。对于SET-2白血病模型,在严重联合免疫缺陷的米色小鼠的右胁腹皮下注射5×106个肿瘤细胞。将细胞重悬于50μL无血清生长培养基中,与Matrigel 1:1混合,并以100μL的总体积注射。通过卡尺测量确定肿瘤体积,并且当肿瘤达到280mm 3的平均体积(肿瘤体积(mm 3)=(w 2×1)/ 2)31天后开始药物治疗。该研究使用每组12只小鼠进行,并且在第18天给药后3小时处死动物。计算肿瘤生长抑制。对于功效研究,通过口服强饲法(10mL / kg体重)治疗小鼠,剂量为50至150mg / kg SB1518。
2.2)老鼠和狗[3]
在该研究中使用雄性Wistar大鼠(年龄6-8周,体重270至325g)和雄性Beagle犬(6至7个月大,体重9-11kg)。狗和大鼠的口服剂量分别为3和10mg / kg。通过管饲法将剂量作为悬浮液(0.5%甲基纤维素和0.1%吐温80)给予大鼠,并作为明胶胶囊给予狗。口服给药后,在含有K3EDTA作为抗凝血剂的试管中,在不同时间点(0至24小时)收集连续血液样品(狗的颈静脉和大鼠上腔静脉),并离心,分离血浆并储存于 - 70℃直至分析。通过LC / MS / MS处理和分析血浆样品。使用WinNonlin通过非房室方法估计药代动力学参数。

3)激酶实验
所有测定均在384孔白色微量滴定板中进行。化合物(例如,Pacritinib)从10μM开始以8个步骤连续稀释4倍。反应混合物由25μL测定缓冲液(50mM HEPES pH 7.5,10mM MgCl 2,5mM MnCl 2,1mM DTT,0.1mM Na 3 VO4,5mMβ-甘油磷酸盐)组成。对于FLT3测定,该反应含有2.0μg/ mL FLT3酶,5μM聚(Glu,Tyr)底物和4μMATP。对于JAK1测定,该反应含有2.5μg/ mL的JAK1酶,10μM的聚(Glu,Ala,Tyr)底物和1.0μM的ATP。对于JAK2测定,该反应含有0.35μg/ mL的JAK2酶,10μM的聚(Glu,Ala,Tyr)底物和0.15μM的ATP。对于JAK3测定,该反应含有3.5μg/ mL的JAK3酶,10μM的聚(Glu,Ala,Tyr)底物和6.0μM的ATP。对于TYK2测定,该反应含有2.5μg/ mL的TYK2酶,10μM的聚(Glu,Ala,Tyr)底物和0.15μM的ATP。将反应物在室温下温育2小时,然后加入13μLPKLight检测试剂。孵育10分钟后,在多标签板读数器上读取发光信号[1]。

综上所述,Pacritinib(SB1518)是JAK2和FLT3的有效和特异性抑制剂(IC50:23/22 nM,在无细胞试验中)。它的靶点活性为FLT3,22nM;FLT3 (D835Y),6nM;JAK2,23nM;JAK2 (V617F),19nM;JAK3,520nM;Tyk2,50nM。

参考文献:
[1]. Hart S, et al. SB1518, a novel macrocyclic pyrimidine-based JAK2 inhibitor for the treatment of myeloid and lymphoid malignancies. Leukemia. 2011 Nov;25(11):1751-9.
[2]. Hart S, et al. Pacritinib (SB1518), a JAK2/FLT3 inhibitor for the treatment of acute myeloid leukemia. Blood Cancer J. 2011 Nov;1(11):e44.
[3]. William AD, et al. Discovery of the macrocycle 11-(2-pyrrolidin-1-yl-ethoxy)-14,19-dioxa-5,7,26-triaza-tetracyclo[19.3.1.1(2,6).1(8,12)]heptacosa-1(25),2(26),3,5,8,10,12(27),16,21,23-decaene (SB1518), a potent Janus kinase 2/fms-like tyrosine kinase-3 (JA

相关化合物:Pacritinib

上一篇:TAK-659 hydrochloride_生物活性与实验方法

下一篇:S-鲁索替尼(INCB018424)的生物活性和实验方法