Pacritinib(SB1518)_生物活性和实验方法

Pacritinib 是一种有效的野生型 JAK2 和 JAK2V617F 突变型抑制剂，IC50 分别为 23 nM 和 19 nM。Pacritinib 也抑制 FLT3及其突变型FLT3D835Y，IC50 分别为 22 nM 和 6 nM。

一、Pacritinib的生物活性：
1）体外活性
相对于JAK2，Pacritinib（SB1518）对TYK2的效力低两倍（IC50 = 50 nM），对JAK3的效力低23倍（IC50 = 520 nM），对JAK1的效力低56倍（IC50 = 1280 nM） 。其余评价的激酶在相当于其米氏常数（Km）的三磷酸腺苷浓度下针对100nM Pacritinib进行测试时显示<30％的抑制。 Pacritinib抑制MV4-11和MOLM-13细胞（两者都是源自由FLT3 ITD突变驱动的人急性髓性白血病的细胞系），IC50分别为47和67nM。 Pacritinib抑制Karpas 1106P和Ba / F3-JAK2V617F细胞（它们是依赖于JAK2信号传导的细胞系），IC50分别为348和160 nM [1]。将含有MV4-11细胞的FLT3-ITD用不同浓度的Pacritinib（SB1518）和pFLT3处理3小时，定量pSTAT5和pERK1 / 2水平。 Pacritinib导致pFLT3，pSTAT5，pERK1 / 2和pAkt的剂量依赖性降低，IC50分别为80,40,33和29nM。与MV4-11和MOLM-13细胞中的FLT3-ITD相比，RS4; 11中FLT3-wt的自磷酸化IC50高4倍（IC50 = 600nM）。然而，在低得多的Pacritinib浓度下检测到STAT5抑制作用（IC50 = 8 nM）[2]。

Pacritinib是野生型JAK2和JAK2V617F突变体的有效抑制剂（IC50：19 nM）。 Pacritinib的IC50对于TYK2为50nM，对于JAK3为520nM，对于JAK1为1280nM。 Pacritinib有效地渗透细胞以调节JAK2下游的信号传导途径，无论是激动剂激活还是突变激活。 Pacritinib在JAK2WT-和JAK2V617F依赖性细胞中诱导细胞凋亡，细胞周期停滞和抗增殖作用。 Pacritinib分别抑制Karpas 1106P（IC50：348nM）和Ba / F3-JAK2V617F（IC50：160nM）的细胞增殖。 Pacritinib分别抑制来自红细胞（IC50：63 nM）和骨髓祖细胞（IC50：53 nM）的内源性集落生长[1]。 SB1518还抑制FLT3及其突变体FLT3-D835Y（IC50：6nM）。 Pacritinib在FLT3-内部串联重复（ITD），FLT3-wt细胞和原代AML胚细胞中抑制FLT3磷酸化和下游STAT，MAPK和PI3K信号传导。 Pacritinib治疗导致携带MV4-11细胞的FLT3-ITD中pFLT3，pSTAT5，pERK1 / 2和pAkt的剂量依赖性降低，IC50分别为80,40,33和29nM。用Pacritinib处理原代AML胚细胞3小时导致pFLT3，pSTAT3和pSTAT5的剂量依赖性降低，IC50低于0.5μM。 Pacritinib在FLT3突变体和FLT3-wt细胞中诱导细胞凋亡，细胞周期停滞和抗增殖作用。 Pacritinib抑制携带FLT3-ITD的细胞MV4-11（IC50：47nM）和原代AML blast（IC50：0.19-1.3nM）细胞的细胞增殖。

2）体内活性
为了评估Ba / F3-JAK2V617F植入模型中的功效，用口服50或150mg / kg剂量的Pacritinib（SB1518）处理小鼠。 q.d.在细胞接种后4天开始药物给药13天。在研究终止时，载体对照小鼠表现出脾肿大和肝肿大（分别为约7倍和1.3倍），使人联想到症状性骨髓纤维化患者的症状。 SB1518治疗150 mg / kg p.o. q.d.显着改善所有这些症状，脾脏重量正常化60％（±9％），肝脏重量正常化92％（±5％），耐受性良好，无明显体重减轻或任何血液学毒性，包括血小板减少和贫血[1] 。在大鼠中，Pacritinib（SB1518）显示出适度快速吸收（tmax = 4 h），峰值浓度为114 ng / mL，AUC为599 ng•h / mL，单次终末半衰期为6 h口服剂量为10毫克/千克。在狗中，Pacritinib（SB1518）被迅速吸收（tmax = 2.0 h），峰值浓度为~12 ng / mL，AUC为53 ng•h / mL，单次口服后终末半衰期为3.4 h剂量为3毫克/千克[3]。

在JAK2V617F依赖性异种移植模型中，Pacritinib（150 mg / kg，po，qd）显着改善脾肿大和肝肿大症状，脾脏重量正常化60％，肝脏重量正常化92％，耐受性良好，无明显体重减轻或任何血液学 毒性，包括血小板减少和贫血。 在JAK2V617F依赖的SET-2异种移植模型中，Pacritinib剂量依赖性抑制肿瘤生长（75mg / kg为40％，150mg / kg为61％）[1]。 Pacritinib每日一次治疗连续21天，诱导肿瘤生长的剂量依赖性抑制（25mg / kg为38％，50mg / kg为92％，100mg / kg为121％）。 对于50和100mg / kg /天组，分别在3/10和8/8小鼠中观察到完全消退。

二、Pacritinib的实验方法：
1）细胞实验
使用SET-2和Karpas 1106P细胞，以及Ba / F3-JAK2V617F-GFP-Luc细胞。 对于96孔板中的增殖测定，将细胞以30-50％汇合接种，并在第二天用化合物（例如Pacritinib）（一式三份）以高达10μM的浓度处理48小时。 使用CellTiter-Glo测定监测细胞活力。 绘制剂量 - 反应曲线以使用XL-fit软件确定化合物的IC 50值[1]。

2）动物实验
2.1）小鼠[1]
使用12周龄的雌性无胸腺BALB / c裸鼠（BALB / cOlaHsd-Foxn1nu）;使用9-10周龄的雌性SCID米色小鼠（CB17.Cg-PrkdcscidLystbg / Crl）。对于SET-2白血病模型，在严重联合免疫缺陷的米色小鼠的右胁腹皮下注射5×106个肿瘤细胞。将细胞重悬于50μL无血清生长培养基中，与Matrigel 1：1混合，并以100μL的总体积注射。通过卡尺测量确定肿瘤体积，并且当肿瘤达到280mm 3的平均体积（肿瘤体积（mm 3）=（w 2×1）/ 2）31天后开始药物治疗。该研究使用每组12只小鼠进行，并且在第18天给药后3小时处死动物。计算肿瘤生长抑制。对于功效研究，通过口服强饲法（10mL / kg体重）治疗小鼠，剂量为50至150mg / kg SB1518。
2.2）老鼠和狗[3]
在该研究中使用雄性Wistar大鼠（年龄6-8周，体重270至325g）和雄性Beagle犬（6至7个月大，体重9-11kg）。狗和大鼠的口服剂量分别为3和10mg / kg。通过管饲法将剂量作为悬浮液（0.5％甲基纤维素和0.1％吐温80）给予大鼠，并作为明胶胶囊给予狗。口服给药后，在含有K3EDTA作为抗凝血剂的试管中，在不同时间点（0至24小时）收集连续血液样品（狗的颈静脉和大鼠上腔静脉），并离心，分离血浆并储存于 - 70℃直至分析。通过LC / MS / MS处理和分析血浆样品。使用WinNonlin通过非房室方法估计药代动力学参数。

3）激酶实验
所有测定均在384孔白色微量滴定板中进行。化合物（例如，Pacritinib）从10μM开始以8个步骤连续稀释4倍。反应混合物由25μL测定缓冲液（50mM HEPES pH 7.5,10mM MgCl 2,5mM MnCl 2,1mM DTT，0.1mM Na 3 VO4,5mMβ-甘油磷酸盐）组成。对于FLT3测定，该反应含有2.0μg/ mL FLT3酶，5μM聚（Glu，Tyr）底物和4μMATP。对于JAK1测定，该反应含有2.5μg/ mL的JAK1酶，10μM的聚（Glu，Ala，Tyr）底物和1.0μM的ATP。对于JAK2测定，该反应含有0.35μg/ mL的JAK2酶，10μM的聚（Glu，Ala，Tyr）底物和0.15μM的ATP。对于JAK3测定，该反应含有3.5μg/ mL的JAK3酶，10μM的聚（Glu，Ala，Tyr）底物和6.0μM的ATP。对于TYK2测定，该反应含有2.5μg/ mL的TYK2酶，10μM的聚（Glu，Ala，Tyr）底物和0.15μM的ATP。将反应物在室温下温育2小时，然后加入13μLPKLight检测试剂。孵育10分钟后，在多标签板读数器上读取发光信号[1]。

综上所述，Pacritinib（SB1518）是JAK2和FLT3的有效和特异性抑制剂（IC50：23/22 nM，在无细胞试验中）。它的靶点活性为FLT3,22nM；FLT3 (D835Y),6nM；JAK2,23nM；JAK2 (V617F),19nM；JAK3,520nM；Tyk2,50nM。

参考文献：
[1]. Hart S, et al. SB1518, a novel macrocyclic pyrimidine-based JAK2 inhibitor for the treatment of myeloid and lymphoid malignancies. Leukemia. 2011 Nov;25(11):1751-9.
[2]. Hart S, et al. Pacritinib (SB1518), a JAK2/FLT3 inhibitor for the treatment of acute myeloid leukemia. Blood Cancer J. 2011 Nov;1(11):e44.
[3]. William AD, et al. Discovery of the macrocycle 11-(2-pyrrolidin-1-yl-ethoxy)-14,19-dioxa-5,7,26-triaza-tetracyclo[19.3.1.1(2,6).1(8,12)]heptacosa-1(25),2(26),3,5,8,10,12(27),16,21,23-decaene (SB1518), a potent Janus kinase 2/fms-like tyrosine kinase-3 (JA