丙氨酸布立尼布的作用和生物活性

丙氨酸布立尼布是血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）抑制剂的丙氨酸盐，具有潜在的抗肿瘤活性。布立尼布强烈结合并抑制VEGFR2，这是一种几乎完全在血管内皮细胞上表达的酪氨酸激酶受体;VEGFR2的抑制可导致肿瘤血管生成的抑制，肿瘤细胞生长的抑制和肿瘤消退。

一、丙氨酸布立尼布的生物活性详解：
1）体外活性
丙氨酸布立尼布抑制VEGF和FGF刺激的HUVECs增殖，IC50分别为40nM和276nM。丙氨酸布立尼布抑制CYP2C19，CYP3A4(BFC)和CYP3A4(BzRes)细胞，IC50分别为2.4μM，0.51μM和1.6μM。丙氨酸布立尼布固态稳定性较高，在50°C下放置干燥剂的12周期间仅有0.3％降解，在pH为6.5时也具有较好的液态稳定性。布立尼布抑制VEGFR1和FGFR-1，IC50为0.38μM和0.148μM。布立尼布对PDGFRβ，EGFR，LCK，PKCα或JAK-3不敏感，IC50均高于1900nM。

布立尼布可抑制VEGF刺激的HUVEC的增殖，IC50为40nM，而FGF刺激的HUVEC中为276nM。另一方面，布立尼布对肿瘤细胞系表现出低活性[1]。布立尼布剂量≤20μM反常增强FGF诱导的LX-2细胞增殖，而较高的布立尼布剂量（≥30μM）抑制LX-2细胞增殖。布立尼布对肝纤维化的抑制作用不是通过抑制TGF-β1诱导的星状细胞活化，而是可能通过抑制PDGF-BB诱导的星状细胞活化[3]。

2μM丙氨酸布立尼布明显抑制VEGF和bFGF刺激的SK-HEP1细胞和HepG-2细胞中VEGFR-2，FGFR-1，ERK1/2和Akt的磷酸化，而丙氨酸布立尼布单独作用于未经刺激的细胞，则不影响ERK1/2，Akt，VEGFR-2和FGFR-1的磷酸化水平。

2）体内活性
25mg/kg丙氨酸布立尼布在大鼠中AUC为13.4μM×hr，Cmax为6.4μM。50mg/kg丙氨酸布立尼布在小鼠中AUC为136μM×hr，Cmax为41μM。50mg/kg和100mg/kg丙氨酸布立尼布作用于携带病患衍生的移植瘤06-0606的小鼠，抑制肿瘤生长速度分别为55%和13%。口服60mg/kg丙氨酸布立尼布显著降低携带病患衍生的移植瘤06-0606的小鼠中肿瘤重量，促进细胞凋亡，降低微血管密度，抑制细胞增殖，并下调细胞周期调控。

布立尼布在无胸腺小鼠的H3396异种移植物中显示出抗肿瘤活性。在剂量为60和90mg/kg（口服）时，布立尼布完全抑制肿瘤生长，TGI分别为85％和97％[1]。此外，布立尼布显着抑制肝细胞癌（HCC）异种移植物中的肿瘤生长，这是由于VEGFR2的磷酸化降低。结果显示06-0606异种移植小鼠的肿瘤重量分别为55％和13％，与对照组相比，剂量为50mg/kg和100mg/kg。建议布立尼布有效治疗HCC[2]。布立尼布（50mg/kg，口服）减轻小鼠体内BDL诱导的肝纤维化和星状细胞活化。布立尼布抑制假对照动物的生长因子和生长因子受体mRNA表达，但在胆管结扎动物中表现出不同的作用[3]。

小鼠口服60mg/kg丙氨酸布立尼布，迅速吸收，Tmax为1小时，半衰期(t1/2)为2.7小时，平均滞留时间为3.6小时。60mg/kg和90mg/kg丙氨酸布立尼布剂量依赖性抑制携带H3396移植瘤的无胸腺小鼠中肿瘤生长，肿瘤生长抑制率分别为85%和97%。80mg/kg和107mg/kg。丙氨酸布立尼布处理携带L2987非小细胞肺癌移植瘤的无胸腺小鼠，剂量依赖性抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率分别为85%和97%。100mg/kg丙氨酸布立尼布抑制两种携带移植瘤的小鼠模型（L2987和HCT116）中血管内皮细胞的增长。

二、丙氨酸布立尼布的活性实验方法：
1）动物实验
4-6周龄的雄性小鼠每周处理3次，总共12次腹膜内（i.p.）注射150mL/kgTAA。在TAA治疗开始时，安慰剂或布立尼布（25或50mg/kg）连续5天口服给药，周末休息。在注射开始后4周处死动物[3]。

2）细胞实验
细胞在96孔胶原IV包被的板中以100×L的最小生长培养基和1.0％热灭活的胎牛血清生长，密度为2×103/孔，在37℃/5％CO2环境中。二十四小时后，将血清调节至10％，并将各种稀释度的丙氨酸布立尼布加入到含有10％血清的最终体积的最小生长培养基中的每个孔中。48小时后，在20μL基本培养基中加入0.5μCi[3H]胸苷24小时。将板在PBS中洗涤一次。除去PBS后，将胰蛋白酶加入细胞中，随后使用自动收获器将其收获到玻璃纤维滤器上。使用β-计数器量化掺入的氚。产生剂量-反应曲线以确定IC50值，其定义为与未处理的血清刺激细胞相比抑制50％氚掺入所需的药物浓度。

3）激酶实验
激酶抑制测定：对于VEGFR2，Flk1和FGFR1激酶测定，将丙氨酸布立尼布溶解在DMSO中并用水/10％DMSO稀释至最终DMSO浓度为2％。激酶反应由8ng具有GST标签的酶，75μg/mL底物，1μMATP和50μL总反应体积中的0.04μCi[γ-33P]ATP组成（激酶缓冲液：20mMTris，pH7.0,25μg/mLBSA，1.5mMMnCl2,0.5mM二硫苏糖醇）。在所有情况下，将反应物在27℃温育60分钟并通过加入冷的三氯乙酸（TCA）终止至终浓度为15％。通过非线性回归分析确定来自激酶测定的抑制百分比，并且将数据报告为相对于对照反应实现50％抑制所需的抑制浓度（IC50）。

综上所述：丙氨酸布立尼布布立尼布alaninate是一种ATP竞争性的VEGFR2抑制剂，IC50值为25nM；可以适度抑制VEGFR1和FGFR1，对VEGFR2的选择性是对PDGFRβ的240倍。它的靶点活性为FGFR1,148nM；Flk1,89nM；VEGFR1,380nM；VEGFR2,25nM。

参考文献：
[1]. Bhide RS, et al. Discovery and preclinical studies of (R)-1-(4-(4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yloxy)-5- methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yloxy)propan- 2-ol (BMS-540215), an in vivo active potent VEGFR-2 inhibitor. J Med Chem, 2006, 49 (7), 2143-2146.
[2]. Huynh H, et al. Brivanib alaninate, a dual inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor and fibroblast growth factor receptor tyrosine kinases, induces growth inhibition in mouse models of human hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2008, 14(19), 6146-6153.
[3]. Nakamura I, et al. Correction: Brivanib Attenuates Hepatic Fibrosis In Vivo and Stellate Cell Activation In Vitro by Inhibition of FGF, VEGF and PDGF Signaling. PLoS One. 2015 Nov 3;10(11):e0142355.