多韦替尼的作用和生物活性

发布时间:2018-10-31 18:03:02 编辑作者:活性达人

多韦替尼图片

图片:多韦替尼结构式

多韦替尼(TKI258,CHIR258)是一种多靶点RTK抑制剂,主要用于III类(FLT3/c-Kit,IC50:1/2nM),对IV类(FGFR1/3)和V类(VEGFR1-4)RTK也有效。(IC50:8-13nM),对EGFR,InsR,EphA2,c-Met,IGF-1R,Tie2和HER2的效力较低。

一、多韦替尼的生物活性详解:
1)体外活性
多韦替尼有效抑制FGF刺激的WT和F384L-FGFR3表达B9细胞的生长,IC50值为25nM。B9-MINV细胞在高达1μM的浓度下对多韦替尼的抑制活性具有抗性。多韦替尼抑制KMS11(FGFR3-Y373C),OPM2(FGFR3-K650E)和KMS18(FGFR3-G384D)细胞的细胞增殖,IC50值分别为90nM(KMS11和OPM2)和550nM[1]。多韦替尼显着降低SK-HEP1和21-0208细胞中FGFR-1,FGFR底物2α(FRS2-α)和ERK1/2的基础磷酸化水平,但不显着降低Akt[2]。多韦替尼增强BMP-2诱导的碱性磷酸酶(ALP)诱导,这是成骨细胞分化的代表性标志物。

多韦替尼还可以刺激磷酸化Smad1/5/8向细胞核的转位和丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化,包括ERK1/2和p38[3]。多韦替尼强烈抑制TNIK与ATP(Ki,13nM)的相互作用和Wnt信号传导因子如β-catenin和TCF4的激活。多韦替尼还诱导IM-9细胞中的caspase依赖性细胞凋亡,而在PBMC中没有显着的细胞毒性[4]。

2)体内活性
多韦替尼(10mg/kg,30mg/kg,60mg/kg,po)在携带KMS11的小鼠模型中显示出显着的抗肿瘤作用,10mg/ml的生长抑制率为48%,78.5%和94%与安慰剂治疗的小鼠相比,分别为kg,30mg/kg和60mg/kg治疗组[1]。多韦替尼(50和75mg/kg)分别导致97%和98%的肿瘤生长抑制,最大疗效为50mg/kg[2]。

二、多韦替尼的活性实验方法:
1)动物实验
如前所述制备异种移植小鼠模型。简而言之,将6至8周龄雌性BNX小鼠皮下接种于右侧腹部,在150μLIMDM中加入3×107KMS11细胞,以及150μL基质胶基底膜基质。当肿瘤达到200mm3的体积时开始治疗,此时小鼠随机接受10,30或60mg/kg多韦替尼或5mM柠檬酸盐缓冲液。通过强饲法每天给药21天。每个治疗组包括8至10只小鼠。每周两次进行卡尺测量以估计肿瘤体积,使用以下公式:4π/3×(宽度/2)2×(长度/2)。单因素方差分析用于比较载体和多韦替尼治疗组之间的差异。

2)细胞实验
根据制造商的说明,通过3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四唑(MTT)染料吸光度评估细胞活力。将细胞以每孔5000个(B9细胞)或20000个(MM细胞系)细胞的密度接种在96孔板中。将细胞与30ng/mLaFGF和100μg/mL肝素或1%IL-6一起孵育,其中指示并增加浓度的多韦替尼。对于每种浓度的多韦替尼,加入在培养基中稀释的10-μL等分试样的药物或DMSO。对于药物组合研究,将细胞与0.5μM地塞米松,100nM多韦替尼或两者同时孵育。

为了评估多韦替尼对粘附于BMSC的MM细胞生长的影响,在存在或不存在多韦替尼的情况下,在BMSC包被的96孔板上培养10000个KMS11细胞。将板孵育48至96小时。为了评估巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)介导的生长,将5000M-NFS-60细胞/孔与连续稀释的CHIR-25ZS8与10ng/mLM-CSF一起孵育,没有粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)。72小时后,使用CellTiter-GloAssay测定细胞活力。每个实验条件一式三份进行。

3)激酶实验
用时间分辨荧光(TRF)或放射性形式测定多韦替尼抑制RTK的50%抑制浓度(IC50)值,测量多韦替尼通过相应酶将磷酸盐转移到底物上的抑制。在50mMHEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸),pH7.0,2mMMgCl2,10mMMnCl21mM中测定FGFR3,FGFR1,PDGFR-β和VEGFR1-3的激酶结构域。NaF,1mM二硫苏糖醇(DTT),1mg/mL牛血清白蛋白(BSA),0.25μM生物素化肽底物(GGGGQDGKDYIVLPI)和1至30μM三磷酸腺苷(ATP),取决于各酶的Km。ATP浓度等于或略低于Km。

对于c-KIT和FLT3反应,在0.25至1μM生物素化的肽底物(GGLFDDPSYVNVQNL)存在下,用0.2至8μMATP将pH升至7.5。将反应物在室温下温育1至4小时,并在含有终止反应缓冲液(25mMEDTA[乙二胺四乙酸],50mMHEPES,pH7.5)的链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板上捕获磷酸化肽。使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66,用DELFIATRF系统测量磷酸化肽。使用XL-Fit数据分析软件4.1版,使用非线性回归计算多韦替尼对IC50的浓度。使用IC50ProfilerExpress服务确定集落刺激因子-1受体(CSF-1R),PDGFR-α,胰岛素受体(InsR)和胰岛素样生长因子受体1(IGFR1)激酶活性的抑制。

综上所述:多韦替尼是多靶点的酪氨酸激酶抑制剂,抑制FLT3,c-Kit,FGFR1/3,VEGFR1/2/3和PDGFRα/β的IC50值分别为1,2,8/9,10/13/8,27/210nM。它的靶点活性为c-Kit,2nM;FGFR1,8nM;FGFR3,9nM;FLT3,1nM;VEGFR3/FLT4,8nM。

参考文献:
[1]. Trudel S, et al. CHIR-258, a novel, multitargeted tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of t(4;14) multiple myeloma. Blood. 2005, 105(7), 2941-2948.
[2]. Huynh H, et al. Dovitinib demonstrates antitumor and antimetastatic activities in xenograft models of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2012, 56(3), 595-601.
[3]. Lee Y, et al. A Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor, Dovitinib (TKI-258), Enhances BMP-2-Induced Osteoblast Differentiation In Vitro. Mol Cells. 2016 May 31;39(5):389-94
[4]. Chon HJ, et al. Traf2- and Nck-interacting kinase (TNIK) is involved in the anti-cancer mechanism of dovitinib in human multiple myeloma IM-9 cells. Amino Acids. 2016 Jul;48(7):1591-9.

相关化合物:多韦替尼

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