双马来酸盐阿法替尼的生物活性和实验方法

双马来酸盐阿法替尼是一种不可逆的 EGFR/HER2 抑制剂，有效作用于野生型和突变型 EGFR 和 HER2，作用于 EGFRwt，EGFRL858R，EGFRL858R/T790M 和 HER2，IC50 分别为 0.5 nM，0.4 nM，10 nM 和 14 nM。

一、双马来酸盐阿法替尼的生物活性：
1）体外活性
在无细胞体外激酶测定中，双马来酸盐阿法替尼对EGFR和HER2的野生型和突变体形式显示出强效活性，类似于吉非替尼对L858R EGFR的效力，但对抗吉非替尼抗性的活性约高100倍。 L858R-T790M EGFR双突变体，IC50为10 nM。此外，BIBW2992与拉帕替尼和卡那替尼相比具有针对HER2的体外效力，IC50为14nM。该评估中最敏感的激酶是lyn，IC50为736 nM [1]。 阿法替尼是这些ErbB家族受体的不可逆抑制剂。食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系对阿法替尼敏感，IC50浓度在较低的微摩尔范围内（培养48小时：HKESC-1 = 78 nM，HKESC-2 = 115 nM，KYSE510 =3.182μM，SLMT-1 =4.625μM，EC-1 =1.489μM;孵育72小时：HKESC-1 = 2 nM，HKESC-2 = 2 nM，KYSE510 =1.090μM，SLMT-1 =1.161μM，EC-1 = 109 nM）最大生长抑制超过95％。 阿法替尼可以剂量和时间依赖的方式强烈诱导HKESC-2和EC-1中的G0 / G1细胞周期停滞[2]。在表达野生型(H1666)或L858R/T790M (NCI-H1975) EGFR的肺癌细胞系中，阿法替尼能够更有效的抑制细胞生长。在表达HER2 776insV (NCI-H1781) 或EGFR E746_A750del (HCC827)的NSCLC细胞系中，阿法替尼能够更抑制细胞生长。

2）体内活性
一旦治疗开始，阿法替尼（15mg / kg）强烈抑制HKESC-2肿瘤的生长。 车辆的平均肿瘤大小和终点治疗分别为348±24 mm3和108±36 mm3，两者之间存在显着差异。 显然，在阿法替尼给药结束后，肿瘤大小不会在短时间内反弹。 在整个治疗过程中体重没有快速变化表明阿法替尼的毒性很小，这种药物耐受性良好[2]。在MDA-MB-453移植瘤模型中，口服给药 阿法替尼（20 mg/kg），下调EGFR和AKT磷酸化水平，能够诱导肿瘤衰退。在HER2阳性胃癌NCI-N87移植瘤模型中，口服 阿法替尼（25 mg/kg）能够消除肿瘤。在A7、A431、FaDu、UT-SCC-14和UT-SCC-15移植瘤模型中，口服给药阿法替尼（30 mg/kg）能够抑制肿瘤生长。

二、双马来酸盐阿法替尼的实验方法：
1）细胞实验
将人ESCC细胞系EC-1，HKESC1和HKESC2，SLMT1和KYSE510在含有10％胎牛血清（FBS）的RPMI中培养。 使用MTT通过比色测定评估细胞毒性。 将肿瘤细胞在各孔培养基中的48孔板（每孔3000-8000个细胞）中培养。 在细胞铺板后24小时加入完全培养基中的阿法替尼，并在37℃，5％CO 2下孵育48和72小时。 细胞生长抑制表示为用酶标仪在570nm处测量的对照培养物的吸光度百分比，并且通过GraphPad PRISM计算50％的最大生长抑制（IC 50）。 在每个实验中，对于每种药物浓度（n = 3）进行三个重复的孔，并且在三个独立的实验中重复测定[2]。

2）动物实验
小鼠[2]-使用体重约16-20克的六周龄雌性无胸腺裸鼠（nu / nu）。 通过将HKESC-2（重悬于50μLHBSS缓冲液中的6×104细胞）皮下接种到裸鼠的两侧，建立ESCC异种移植物。 当肿瘤大小达到4-6mm直径时，它们在治疗（15mg / kg）或媒介物对照组中随机化。 用于治疗的阿法替尼通过在给药前溶解在0.5％甲基纤维素中来制备。 通过口服强饲法将药物或媒介物以5天的时间表给予小鼠，加上2天，连续两周。 通过用卡尺监测肿瘤大小的变化来评估药物功效。 用公式肿瘤体积=（宽度2×长度）/ 2计算肿瘤体积。

3）激酶实验
感染后72小时，用HEPEX（20mM HEPES pH 7.4,100mM NaCl，10mMβ-甘油磷酸酯，10mM对硝基苯基磷酸酯，30mM NaF，从Sf9生物质中提取EGFR激酶结构域-GST融合蛋白， 5 mM EDTA，5％甘油，1％Triton X-100,1 mM Na3VO4,0.1％SDS，0.5μg/ mL胃蛋白酶抑制剂A，抑肽酶20 KIU / mL，Leupeptin2μg/ mL，苯甲脒1 mM，2.5μg/ mL 3,4-二氯异香豆素，2.5μg/ mL反式环氧琥珀酰基-L-亮氨酰-L-酰氨基丁烷和0.002％PMSF）并用于测定IC 50值。每个100μL酶反应在50％Me2SO中含有10μLAfatinib（BIBW2992），20μL底物溶液（200 mM HEPES pH 7.4,50 mM Mg-acetate，2.5 mg / mL poly（EY），5μg/ mL bio -pEY）和20μL酶制剂。通过加入50μL在10mM MgCl 2中制备的100μMATP溶液开始酶促反应。测定在室温下进行30分钟，并通过加入50μL终止溶液（在20mM HEPES pH 7.4中的250mM EDTA）终止。将100μL转移至链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板，在室温下孵育60分钟后，用200μL洗涤溶液（50mM Tris，0.05％Tween20）洗涤板。向孔中加入100μL等分试样的HRPO标记的抗PY抗体（PY20H Anti-Ptyr：HRP，由Transduction Laboratories提供）250ng / mL。孵育60分钟后，将板用200μL洗涤溶液洗涤三次。然后用100μLTMB过氧化物酶溶液（A：B = 1：1）显色样品。 10分钟后停止反应。将平板转移至ELISA读数器，并在OD450nm下测量消光。所有数据点一式三份执行[1]。

综上所述，双马来酸盐阿法替尼是一种口服生物可利用的苯胺基 - 喹唑啉衍生物和受体酪氨酸激酶（RTK）表皮生长因子受体（ErbB; EGFR）家族的抑制剂，具有抗肿瘤活性。它的靶点活性为EGFR (L858R),0.4nM；EGFR (L858R/T790M),10nM；EGFR (wt),0.5nM；HER2,14nM。

参考文献：
[1]. Li D, et al. BIBW2992, an irreversible EGFR/HER2 inhibitor highly effective in preclinical lung cancer models. Oncogene. 2008 Aug 7;27(34):4702-11.
[2]. Wong CH, et al. Preclinical evaluation of afatinib (BIBW2992) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Am J Cancer Res. 2015 Nov 15;5(12):3588-99.