埃罗替尼是一种癌症药物，可以干扰癌细胞的生长并减缓它们在体内的传播，用于治疗已扩散至身体其他部位（转移性）的非小细胞肺癌或胰腺癌。
一、埃罗替尼的生物活性详解：
1）体外活性
埃罗替尼（CP-358,774）也是EGFR重组细胞内（激酶）结构域的有效抑制剂，IC50为1 nM。 埃罗替尼强烈抑制DiFi细胞的增殖，对于8天的增殖试验，IC50为100 nM [1]。 与单独的任一种药剂相比，B-DIM和埃罗替尼（2μM）的组合导致BxPC-3细胞中集落形成的显着抑制。 与单独使用任一种药物的细胞凋亡作用相比，B-DIM和埃罗替尼（2μM）的组合仅在BxPC-3细胞中导致显着的细胞凋亡诱导[2]。埃罗替尼能够抑制NSCLC细胞系（A549，H322，H3255，H358，H661，H1650，H1975，H1299，H596）的生长，IC50为29 nM~大于20 μM。 埃罗替尼 HCl还能有效抑制完整细胞（如HNS人头颈部肿瘤细胞，DiFi人结肠癌细胞和MDA MB-468人乳腺癌细胞）中EGFR的活化。在DiFi人结肠癌细胞中，埃罗替尼 HCl（1 μM）诱导细胞凋亡。2 μM 埃罗替尼 HCl可使BxPC-3和AsPC-1胰细胞生长收到明显抑制。 在KRAS突变的胰腺癌细胞中，埃罗替尼 HCl与吉西他滨联合给药具有协同作用。埃罗替尼 HCl（10 μM）抑制Y1068 (自身磷酸化)和Y845 (Src依赖性磷酸化)位点的EGFR磷酸化。结合埃罗替尼 HCl能够使雷帕霉素刺激的Akt活性下调，并对细胞生长产生协同抑制作用。
2）体内活性
在实验条件下，与未处理的对照相比，B-DIM和埃罗替尼（50mg / kg，i.p。）处理的组合显示肿瘤重量显着降低（P <0.01）[2]。 与CP +载体（V）大鼠相比，埃罗替尼（20mg / kg，口服）显着减弱顺铂（CP）诱导的体重（BW）损失（P <0.05）。 埃罗替尼治疗显着改善CP-N（正常对照组，NC）大鼠的肾功能。 CP +埃罗替尼（E）大鼠血清肌酐（s-Cr）水平显着降低（P <0.05），血尿素氮（BUN）（P <0.05），尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 （NAG）指数（P <0.05），与CP + V大鼠相比，尿量（UV）（P <0.05）和Cr清除率（Ccr）显着增加（P <0.05）[3]。埃罗替尼 HCl（100 mg/kg）抑制A549和H460a肿瘤模型，抑制率分别为93%和71%。在异种移植人HN5肿瘤的无胸腺小鼠体内，埃罗替尼 HCl（100 mg/kg）完全防止EGF诱导的EGFR自身磷酸化，并可治疗小鼠的肝EGFR自身磷酸化。
二、埃罗替尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
为了测试用B-DIM，埃罗替尼或其组合处理的细胞的活力，将BxPC-3和MIAPaCa细胞接种（每孔3,000-5,000）在96孔板中并在37℃温育过夜。 最初测试B-DIM（10-50μM）和埃罗替尼（1-5μM）的浓度范围。 基于初始结果，选择B-DIM（20μM）和埃罗替尼（2μM）的浓度用于所有测定。 B-DIM（20μM），埃罗替尼（2μM）和组合对BxPC-3和MIAPaCa细胞的作用在72小时后通过标准MTT测定法测定并重复三次。 通过Tecan微孔板荧光计在595nm处测量颜色强度。 DMSO处理的细胞被认为是未处理的对照并且被指定为100％的值。 除上述检测外，还进行了克隆形成试验，以评估治疗效果[2]。
2）动物实验
小鼠-将雌性ICR-SCID（6-7周龄）小鼠随机分成以下治疗组（n = 7）:( a）未治疗的对照; （b）仅B-DIM（50 mg / kg体重），每天一次胃内灌注; （c）埃罗替尼（50mg / kg体重），每天i.p.为期15天;和（d）B-DIM和埃罗替尼，按照时间表进行个别治疗。在最后一剂治疗后第3天处死所有小鼠，并测定它们的体重。将组织的一部分在液氮中快速冷冻并储存在-70℃下以备将来使用，另一部分在福尔马林中固定并加工成石蜡块。固定组织切片的H＆E染色用于确认每个胰腺中肿瘤的存在。
大鼠-使用体重为180至210g的6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。顺铂（CP）在盐水中以1mg / mL的浓度新鲜制备，然后在第0天以7mg / kg的剂量腹膜内注射SD大鼠（n = 28）。为了研究埃罗替尼，28 CP的作用。 -N-大鼠分为两组。每天通过口服管饲从第-1天开始给每只动物的单独组（n = 14）施用埃罗替尼（20mg / kg）（CP + E，n = 14）或媒介物（CP + V，n = 14）（在CP注射前24小时至第3天。媒介物处理组接受等量的盐水。将6周龄的5只雄性SD大鼠用作正常对照组（NC，n = 5）。从第-1天到第3天，通过口服管饲法每天给NC大鼠施用等量的盐水。在第4天（CP注射后96小时），将每只大鼠麻醉并在心脏穿刺后通过放血处死;通过心脏穿刺收集血液并收集肾脏。肾组织分裂;将分开的部分在液氮中快速冷冻或在2％多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定以备后用。所有手术均在乙醚气体麻醉下进行，并且尽一切努力使痛苦最小化。
3）激酶实验
激酶反应在50μL50mM HEPES（pH 7.3）中进行，含有125 mM NaCl，24 mM MgCl 2,0.1 mMNa3VO4,20μMATP，1.6μg/ mL EGF和15 ng EGFR，从A431亲和纯化细胞膜。加入DMSO中的化合物，使DMSO的最终浓度为2.5％。通过添加ATP引发磷酸化，并在室温下继续进行8mm，持续摇动。通过抽吸反应混合物终止激酶反应，并用洗涤缓冲液洗涤4次。通过用50μL每孔HRP-缀合的PY54抗磷酸酪氨酸抗体孵育25μm的磷酸化PGT，在封闭缓冲液（3％BSA和0.05％吐温20的PBS溶液）中稀释至0.2μg/ mL。通过抽吸除去抗体，并用洗涤缓冲液洗涤板4次。通过添加每孔50μL的TMB微孔过氧化物酶底物培养结肠信号，并通过添加0.09M硫酸，每孔50μL来终止。通过测量450nm处的吸光度来估计磷酸酪氨酸。对照的信号通常为0.6-1.2吸光度单位，在没有AlP，EGFR或POT的孔中基本上没有背景，并且与孵育10毫米的时间成正比[1]。
综上所述：
埃罗替尼抑制纯化的 EGFR 激酶，IC50 为 2 nM。它对EGFR的敏感性比人v-Abl或c-Src高1000倍。它的靶点活性为EGFR,2nM。
参考文献：
[1]. Moyer JD, et al. Induction of apoptosis and cell cycle arrest by CP-358,774, an inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase. Cancer Res. 1997, 57(21), 4838-4848.
[2]. Ali S, et al. Apoptosis-inducing effect of erlotinib is potentiated by 3,3'-diindolylmethane in vitro and in vivo using an orthotopic model of pancreatic cancer. Mol Cancer Ther, 2008, 7(6), 1708-1719.
[3]. Wada Y, et al. Epidermal growth factor receptor inhibition with erlotinib partially prevents cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. PLoS One. 2014 Nov 12;9(11):e111728.
