[ 描述 ]:
Ripasudil free base (K-115 free base) 是 ROCK 特异性抑制剂,能够抑制 ROCK2 和 ROCK1 的活性,IC50 值分别为 19 和 51 nM。
[ 相关类别 ]:
[ 靶点 ]
ROCK2:19 nM (IC50)
ROCK1:51 nM (IC50)
CaMKIIa:370 nM (IC50)
PKACa:2.1 μM (IC50)
PKC:27 μM (IC50)
[体外研究]
Ripasudil(K-115)是ROCK的有效抑制剂,ROCK2和ROCK1的IC50分别为19和51 nM。 Ripasudil对CaMKIIα,PKACα和PKC的抑制活性也较低,IC50分别为370 nM,2.1μM和27μM[1]。 Ripasudil(K-115;1,10μM)诱导细胞骨架变化,包括回缩和细胞变圆以及培养的小梁网(TM)细胞的肌动蛋白束减少。 Ripasudil(5μM)显着降低经内皮电阻(TEER),并增加Schlemm管内皮细胞(SCE)单层细胞的FITC-葡聚糖渗透性[2]。
[体内研究]
Ripasudil(K-115)以浓度依赖性方式降低眼内压(IOP),在猴眼中浓度为0.1％至0.4％,在兔眼中浓度为0.0625％至0.5％[1]。 Ripasudil(K-115; 1 mg/kg,每日口服)显示神经压迫(NC)后视网膜神经节细胞(RGC)的神经保护作用。 Ripasudil还抑制小鼠轴突损伤诱导的氧化应激。 Ripasudil抑制NC损伤后RGC中ROS的时间依赖性产生[3]。
[激酶实验]
将ROCK 1（0.75 ng / mL）和ROCK 2（0.5 ng / mL）与各种浓度的Ripasudil，Y-27632或HA-1077在25°C下在50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中孵育90分钟）含有100mM KCl，10mM MgCl 2,0.1mM EGTA，30mM长S6激酶底物肽和1mM ATP，总体积为40mL。 PKACa，PKC和CaMKIIa也与各种浓度的Ripasudil，Y-27632或HA-1077一起温育。将PKACa（0.0625 ng / mL）在含有20 mM MgCl 2,1 mg / mL BSA，5 mM Kemptide肽底物和1 mM ATP的40 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中于25°C孵育30分钟总体积为40 mL。将PKC（0.025 ng / mL）在含有20 mM MgCl 2,0.4 mM CaCl 2,0.1 mg / mL BSA，0.25 mM EGTA，25 ng / mL的20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中于25°C孵育80分钟磷脂酰丝氨酸，2.5ng / mL二酰基甘油，0.0075％Triton-X-100,25mM DTT，10mM Neurogranin（28-43）肽底物和1mM ATP，总体积为40mL。将CaMKIIa（0.025 ng / mL）在含有10 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0.04 mg / mL BSA，16 mg / mL纯化钙调蛋白的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中于25°C孵育90分钟睾丸，500mM DTT，50mM Autocamitide 2和1mM ATP，总体积为40mL。孵育后，加入40mL KinaseGlo发光激酶测定溶液，并使其在25℃保持10分钟，并使用发光计测量相对光单位（RLU）。不含试验化合物的RLU设定为100％（对照值），不含酶和化合物的RLU设定为0％（正常值）。然后通过添加每种浓度的测试化合物从RLU计算反应速率（对照的％），并且使用SAS [1]通过逻辑回归分析确定50％抑制浓度（IC 50）。
[细胞实验]
将小梁网细胞（TM）细胞以每孔1×10 4个细胞的密度接种在6孔板上，在含有10％FBS的DMEM中。在过夜培养后，当细胞达到半流量时，将1或10μMRipasudil，10μMY-27632或10μM法舒地尔加入培养孔中。 PBS用作对照载体。 60分钟后，除去药物溶液并用含有10％FBS的DMEM代替。通过相差显微镜观察细胞，并在药物施用后60分钟和药物去除后2小时拍照。对于免疫组织化学，将TM细胞以每孔1×10 4个细胞的密度接种在明胶包被的8孔室载玻片上，在含有10％FBS的DMEM中。在过夜培养后，当细胞达到半流量时，将细胞在1或10μM的Ripasudil，10μM的Y-27632或10μM的法舒地尔孵育60分钟。 PBS用作对照载体。取出药物溶液并在2小时后用含有10％FBS的DMEM替换。将细胞用PBS中的4％多聚甲醛固定15分钟，然后用细胞骨架缓冲液（10mM MES，150mM NaCl，5mM EGTA，5mM MgCl 2,5mM葡萄糖，pH 6.1）和血清缓冲液（PBS中10％FBS）洗涤。 ）。细胞用PBS中的0.5％Triton X-100在室温下透化12分钟，并在4℃下用血清缓冲液封闭至少2小时。丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）在室温下用0.05mg / mL鬼笔环肽-TRITC标记1小时。用PBS洗涤后，用含有DAPI的商业封固剂固定细胞，并用荧光显微镜观察。拍摄F-肌动蛋白和DAPI图像的曝光分别为0.1和0.05秒[2]。
[动物实验]
兔子[1]在兔子实验中，将50mL浓度为0.0625％，0.125％，0.25或0.5％的载体或瑞帕司他滴入一只眼睛中。在滴注前和滴注后0.5,1,2,3,4和5小时测量双眼的眼压（IOP）。对侧眼未治疗。给动物施用使用拉丁方法指定的所有浓度的Ripasudil，间隔至少2天。猴子[1]在猴子实验中，将20mL浓度为0.1％，0.2％或0.4％的Ripasudil和浓度为0.005％的拉坦前列素滴注到一只眼睛中。在滴注前和滴注后1,2,4,6和8小时测量双眼的IOP。对侧眼未治疗。使用拉丁方法将动物安排接受所有制剂，间隔至少1周。将IOP与给药前和滴注瑞帕司他后的每个时间点的滴注侧的结果进行比较，并在每个时间点与双眼进行比较。
[参考文献]
[相关活性小分子]