Decernotinib(VX-509)_生物活性与实验方法

Decernotinib（VX-509; VRT-831509）是一种有效的选择性Janus激酶3（JAK3）抑制剂，Ki为2.5 nM; 细胞试验中IC50为50-170nM。

一、Decernotinib的生物活性：
1）体外活性
Decernotinib（VX-509）是一种有效的JAK3抑制剂，JAK3，JAK1，JAK2和TYK2的Kis分别为2.5,11,13和11 nM。 Decernotinib有效阻断T细胞增殖，平均IC50为170±101 nM，并抑制IL-2刺激的T细胞增殖（IC50,140和400 nM）。 VX-509对CD40L和IL-4的反应也对B细胞具有细胞毒性（IC50,50nM）[1]。

2）体内活性
Decernotinib（VX-509,10,25或50mg / kg，口服）显着且剂量依赖性地抑制响应于大鼠胶原注射的踝直径和爪重量的增加。 Decernotinib有效缓解大鼠软骨损伤和骨吸收。 Decernotinib（10,25或50mg / kg，p.o。，b.i.d。）抑制迟发型超敏反应小鼠模型的耳水肿[1]。

二、Decernotinib的实验方法：
1）细胞实验
来自健康志愿者的全血样品用于收集外周血单核细胞，将其以1×106 / mL的密度接种在T75组织培养瓶中。 用10μg/ mL植物血凝素在37℃刺激细胞72小时。 72小时后，通过刮擦，洗涤，以1×105 /孔的密度在96孔板中将细胞从烧瓶上分离。 加入Decernotinib（9.7nM至10μM），将板在37℃温育30分钟，然后用人IL-2刺激。 在两行中，仅添加DMSO; 一行不用IL-2刺激，一行用IL-2刺激作为增殖对照。 将板在37℃下孵育2天。 在第2天，用20μCi/ mL甲基 - [3H]胸苷脉冲细胞18-24小时，并收获到滤器上用于放射照相测定。 使用Softmax pro软件分析数据以生成IC50值[1]。

2）动物实验
大鼠[1]
胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠模型用于评估口服Decernotinib的效果[10 mg / kg bid，25 mg / kg bid，50 mg / kg bid，50 mg / kg qd或100 mg / kg qd关于关节炎症和组织病理学。雌性Lewis大鼠（157-187g）用异氟烷麻醉并在第0天和第6天在尾根部和背部的两个部位注射300μL弗氏不完全佐剂，其含有2mg / mL牛II型胶原。在爪子肿胀（关节炎）开始时将大鼠随机分组研究组，其发生在第10天和第11天之间。在已确定的关节炎的第一天开始通过口服强饲法给予Decernotinib或载体，并且持续至关节炎的第6天。 。剂量体积为5mL / kg。组是对照（没有胶原注射加载体; n = 4），胶原加载体（n = 5），胶原加Decernotinib 10mg / kg b.i.d. （n = 8）;胶原蛋白加Decernotinib 10 mg / kg b.i.d. （n = 8）;胶原蛋白加（n = 8）;胶原蛋白加（n = 8）;胶原蛋白加（n = 8）;胶原蛋白羽（n = 8）;和胶原蛋白加（n = 8）;胶原蛋白羽（n = 8）;所有治疗均给药6天。在研究第11和14天，另一组大鼠给予胶原蛋白加10mg / kg皮下依那西普，一种人肿瘤坏死因子-α拮抗剂，正常（基线）踝关节的卡尺测量在第9天开始并持续到最后一次。学习日。使用Student's t检验测试平均踝直径的差异，显着性设置为P≤0.05。在关节炎的第7天对大鼠实施安乐死，这是研究第17或18天，取决于何时将动物随机分组;收获爪子和膝盖以确定爪子重量并进行炎症（膝盖和踝关节），血管formation形成（踝关节），软骨破坏（膝盖）和骨吸收（膝盖和踝关节）的组织病理学分析。分数范围从0（正常）到5（严重病理学）并由兽医病理学家分配。使用下式计算抑制百分比：[（治疗组的平均值） - （对照的平均值）]÷[（胶原+载体的平均值） - （对照的平均值）]。 Kruskal-Wallis单因素方差非参数检验用于确定组织病理学组间的统计学显着性，显着性设为P≤0.05[1]。

3）激酶实验
通过使用放射测定法测量重组表达的JAK3激酶结构域的残余激酶活性来评估VX-509对JAK3活性的影响。测定中组分的最终浓度如下：100mM HEPES（pH 7.5），10mM MgCl 2,1mM二硫苏糖醇（DTT），0.01％BSA，0.25nM JAK3,0.25mg / ml聚EEY和5μM33P -γ-ATP（200μCi/μmol）。在DMSO中制备10mM VX-509储备溶液，由此制备另外的稀释液。加入底物混合物（100mM HEPES，10mM MgCl 2,0.5mg / ml聚E 4 Y和10μM33P-γ-ATP）并与VX-509储备溶液混合。通过加入酶混合物[100mM HEPES（pH 7.5），10mM MgCl 2,2mM DTT，0.02％BSA，0.5nM JAK3]引发反应。 15分钟后，用20％三氯乙酸（TCA）淬灭反应。将猝灭的反应转移至GF / B滤板并用5％TCA洗涤三次。加入Ultimate Gold闪烁剂（50μl）后，将样品在PackardTopCountγ计数器（PerkinElmer）中计数。在该程序中，捕获的放射性是残余JAK3激酶活性的量度。根据VX-509滴定曲线的活性与浓度，通过使用Prism软件将数据拟合至竞争性紧密结合抑制动力学的方程来确定Ki值。

综上所述：Decernotinib是一种有效的，可口服的 JAK3 抑制剂，对 JAK3，JAK1，JAK2 和 TYK2 的 Ki 值分别为 2.5，11，13 和 11 nM。它的靶点活性为JAK1,11nM(Ki)；JAK2,13nM(Ki)；JAK3,2.5nM(Ki)；Tyk2,13nM(Ki)。

参考文献：
[1]. Mahajan S, et al. VX-509 is a potent and selective Janus kinase 3 (JAK3) inhibitor that attenuates inflammation in animal models of autoimmune disease. J Pharmacol Exp Ther. 2015 Mar 11. pii: jpet.114.221176.