N-丁二酸S-乙酰基巯基乙二醇酯（CAS 76931-93-6）即N-琥珀酰亚胺S-乙酰基巯基乙酸酯，是一种氨基定向修饰试剂。其分子内含有一个琥珀酰亚胺酯基团和一个乙酰基保护的巯基。在弱碱性条件下，琥珀酰亚胺酯与蛋白质赖氨酸ε-氨基发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键，同时将S-乙酰基巯基乙酰基结构共价连接到蛋白质表面。此时引入的巯基处于乙酰基保护状态，化学性质稳定，但无法直接参与偶联或检测。因此，评估修饰效率必须先将乙酰基脱除，暴露游离巯基，再采用比色法或荧光法定量。
检测原理
游离巯基的定量测定采用Ellman法（DTNB法）。DTNB（5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，C₁₄H₈N₂O₈S₂）在pH 7.0～8.5条件下与游离巯基发生定量反应：一个DTNB分子与一个巯基反应，生成一个2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子（TNB⁻，C₇H₄NO₅S⁻）和一个混合二硫化物。TNB⁻在412 nm处具有特征强吸收，其摩尔消光系数为14150 M⁻¹·cm⁻¹。只要测定反应体系在412 nm的吸光度，即可依据朗伯-比尔定律计算体系中的巯基物质的量。由于反应计量比为1:1，该法可直接给出游离巯基浓度，不需要标准曲线。
实验方法
脱保护处理
修饰反应结束后，蛋白样品中含有大量未反应的SATA和水解副产物，必须先通过脱盐柱或透析去除。向纯化后的修饰蛋白中加入羟胺溶液（终浓度0.5 mol/L，pH 7.4，含1 mmol/L EDTA），室温孵育2小时。羟胺作为亲核试剂，特异性断裂S-乙酰基中的硫酯键，释放出游离巯基并生成N-乙酰羟肟酸。此步骤必须彻底，否则将导致后续测定值偏低。脱保护完成后，再次透析或脱盐除去羟胺和乙酰羟肟酸。
Ellman比色测定
将脱盐后的蛋白样品溶于含1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L Tris缓冲液（pH 8.0）中。取适量样品（如100 μL），加入20 μL Ellman试剂（4 g/L DTNB溶于上述缓冲液），用缓冲液补足体积至1 mL，混匀后室温避光反应15分钟。同时制备空白对照（不加蛋白）和未修饰蛋白对照（同浓度原蛋白）。测定各体系在412 nm处的吸光度A₄₁₂。样品吸光度扣除空白后为ΔA₄₁₂。
为确保准确性，蛋白样品浓度应控制在0.1～2 g/L范围内，使ΔA₄₁₂落在0.05～1.5之间。若吸光度过高，需用缓冲液稀释并乘以相应稀释倍数。
蛋白浓度测定
采用BCA法或Bradford法测定同一批脱盐后蛋白样品的浓度。注意两种方法对含有巯基或EDTA的体系耐受性不同，应使用与DTNB缓冲液相容的改良Bradford法。蛋白浓度以摩尔浓度表示，需根据目标蛋白分子量计算。
数据处理与效率计算
巯基浓度计算式：
c(SH) = ΔA₄₁₂ ÷ (14150 × L) × n
其中L为比色皿光程（cm），n为稀释倍数。若使用1 cm比色皿，则c(SH)（mol/L）= ΔA₄₁₂ ÷ 14150 × n。
引入效率定义为每个蛋白分子上成功引入的游离巯基数：
r = c(SH) ÷ c(protein)
例如，某单克隆抗体分子量150 kDa，修饰后测得c(SH)=35.4 μmol/L，c(protein)=5.9 μmol/L，则r=6.0，即每个抗体分子平均引入6个巯基。
该数值反映脱保护后可利用巯基的实际含量，与SATA投料比、反应pH、蛋白表面赖氨酸可及性、脱保护效率均相关。增大SATA与蛋白的摩尔比可提高引入率，但过高的投料比会导致蛋白变性或交联。应同时测量未修饰蛋白的本底巯基（天然游离半胱氨酸），并在计算中扣除。
关键影响因素与控制
第一，pH必须严格控制在7.5～8.5。pH低于7时巯基部分质子化，与DTNB反应速率下降；pH高于8.5时羟胺可能与蛋白的酰胺键发生非特异性裂解，同时巯基更易氧化。第二，缓冲液中必须加入EDTA。痕量金属离子催化巯基氧化为二硫键，使有效巯基浓度下降。操作应在冰上或氮气保护下进行。第三，DTNB反应时间不可过长，15～30分钟内达到稳定，超过1小时因光降解会吸光度漂移。第四，样品必须完全去除游离的小分子硫醇（如脱保护阶段的过量羟胺），否则会与DTNB反应导致假阳性。第五，若蛋白本身含有辅基或色素，应在412 nm处有无本底吸收，可通过未修饰蛋白对照扣除。
结论
采用Ellman法配合羟胺脱保护可准确测定N-丁二酸S-乙酰基巯基乙二醇酯修饰蛋白后暴露的巯基数目。该方法操作简便、重复性好，且无需昂贵仪器。将巯基浓度与蛋白浓度关联，即可获得定量化引入效率，为后续位点特异性偶联（如标记、聚乙二醇化、表面固定）提供关键参数。