CAS号76931-93-6对应的化合物是N-琥珀酰亚胺S-乙酰基硫代乙酸酯，即SATA，也常被称为N-丁二酸S-乙酰基巯基乙二醇酯。其结构式为CH₃CO-S-CH₂-CO-O-N(C(=O)CH₂CH₂C(=O))，分子式为C₈H₉NO₅S。该试剂通过N-羟基琥珀酰亚胺酯与伯胺偶联，将乙酰巯基引入蛋白质、核酸或其他含氨基分子，形成稳定的酰胺键连接。
乙酰巯基保护基的化学稳定性
乙酰巯基是硫醇的硫酯型保护基，其中硫原子与乙酰基的羰基碳直接相连。该基团在pH 6至9的水溶液中水解速率很低，对氧化剂、烷基化试剂和金属离子具有耐受性。因此，经SATA修饰的生物分子可以在常规缓冲液中储存和纯化，而不发生巯基副反应。这为后续经控制性脱保护释放巯基提供了时间窗口。
脱保护试剂：羟胺
去除乙酰巯基的标准试剂是羟胺（NH₂OH）。羟胺属于软亲核体，其氮原子对硫酯羰基的亲和力远高于对普通羧酸酰胺的亲和力。通常使用羟胺盐酸盐或硫酸羟胺，配制成浓度为100 mmol/L的水溶液，并用氢氧化钠调节pH至7.5。脱保护缓冲液中必须含有EDTA，终浓度为25 mmol/L，以螯合催化巯基氧化的过渡金属离子。
反应机理与化学方程
羟胺脱保护的反应式为：
R-NH-CO-CH₂-S-COCH₃ + NH₂OH → R-NH-CO-CH₂-SH + CH₃CONHOH
其中R代表被SATA修饰的分子骨架。反应过程中，羟胺的氮原子对乙酰基羰基碳发动亲核进攻，形成四面体中间体，此中间体随后发生质子转移和断裂，生成游离巯基与乙酰氧肟酸。该机制与碱性水解相似，但羟胺的酰解速率比水分子高数个数量级，因此即使在25℃、pH 7.5的温和条件下，2小时内反应即达到完全转化。
标准脱保护操作条件
在含SATA修饰物的PBS溶液（pH 7.5，含5 mmol/L EDTA）中，加入等体积的100 mmol/L羟胺溶液（pH 7.5，含25 mmol/L EDTA），使羟胺终浓度为50 mmol/L。混合液于25℃静置2小时。反应完毕后，通过Sephadex G-25凝胶过滤柱或透析去除羟胺和乙酰氧肟酸。若目标物对氧化敏感，整个操作须在氮气保护下进行。
影响脱保护效率的关键参数
羟胺必须在反应体系中保持过量，浓度低于10 mmol/L时脱保护速率显著下降。pH低于6时，羟胺发生质子化（NH₃OH⁺），失去亲核能力，反应停止；pH高于8.5时，游离巯基快速氧化为二硫键，且部分乙酰硫酯发生碱水解。温度超过40℃会同时导致羟胺对蛋白质侧链酰胺的催化脱酰胺，因此脱保护必须在25～37℃之间进行。EDTA的浓度不能省略，微量Cu²⁺或Fe³⁺可将巯基氧化为二硫键。
脱保护产物的后续应用
脱保护生成的游离巯基在pH 6.5～7.5范围内可与马来酰亚胺类试剂发生迈克尔加成反应，生成稳定的硫醚键；也可与溴乙酰基或吡啶二硫化物反应。抗体药物偶联物（ADC）制备中，SATA修饰抗体的赖氨酸残基后，以羟胺脱保护得到具有游离巯基的抗体，再与马来酰亚胺-药物连接体偶联，实现定点定量载药。该路径不破坏抗体链间二硫键，且偶联后产物均一。
操作注意事项
羟胺必须在上样偶联反应前完全除去，因其残留会与马来酰亚胺发生副反应。脱保护后的巯基应立即进行后续偶联，或者用N-乙基马来酰亚胺等试剂封闭。乙酰氧肟酸副产物在280 nm处有特征吸收，可在线监控反应进程；游离巯基的绝对量使用Ellman试剂（DTNB）在412 nm处定量。整个脱保护过程应避免使用任何含氧化剂的缓冲液，所有溶液需经脱气处理。