来那替尼的生物活性

来那替尼是一种癌症药物，可干扰体内癌细胞的生长和扩散，用于治疗某种类型的早期乳腺癌。来那替尼（HKI-272）分别是HER2和EGFR的口服，不可逆的酪氨酸激酶抑制剂（IC50：59/92 nM）。 来那替尼不可逆地结合HER-2受体，从而减少细胞中的自身磷酸化，显然是通过靶向受体的ATP结合口袋中的半胱氨酸残基。

一、来那替尼的生物活性详解：
1）体外活性
来那替尼对酪氨酸激酶KDR和Src具有抑制作用，IC50分别为0.8μM和1.4μM，与HER2相比，活性降低14倍和24倍。 来那替尼对其他丝氨酸 - 苏氨酸激酶没有活性，如Akt，细胞周期蛋白D1 / cdk4，细胞周期蛋白E / cdk2，细胞周期蛋白B1 / cdk1，IKK-2，MK-2，PDK1，c-Raf和Tpl-2，以及作为酪氨酸激酶c-Met。 来那替尼选择性抑制转染HER2（3T3 / neu）的3T3细胞以及其他两种HER-2过表达SK-Br-3和BT474细胞的增殖，IC50值为2-3 nM，显示> 230倍与未转染的3T3细胞以及EGFR-和HER2-阴性的MDA-MB-435和SW620相比具有效力。 来那替尼还抑制EGFR依赖性A431细胞的增殖，IC50为81 nM。 来那替尼降低BT474细胞中HER2受体的自身磷酸化，IC5​​0为5 nM，A431细胞中EGFR依赖于EGFR的磷酸化，IC5​​0为3 nM。 来那替尼阻断HER-2导致下游MAPK和Akt通路的抑制，IC50为2 nM，比曲妥珠单抗更有效。 来那替尼抑制BT474细胞中细胞周期蛋白D1的表达和Rb易感基因的磷酸化，IC5​​0为9 nM，导致G1-S停滞，最终导致细胞增殖减少[1]。

2）体内活性
口服治疗的来那替尼显着抑制3T3 / neu异种移植物的生长，分别在10,20,40和80mg / kg /天的剂量下抑制34％，53％，98％和98％。 与在40mg / kg /天给药1小时内HER-2磷酸化抑制84％相一致，来那替尼在5,10的剂量下抑制BT-744异种移植物的生长70-82％，67％和93％ ，和40毫克/千克/天。 来那替尼对SK-OV-3异种移植物也有效，在5和60mg / kg /天时分别抑制31％和85％。 与HER-2依赖性肿瘤相比，来那替尼对EGFR依赖性A431异种移植物的效力较低，分别在5和20mg / kg /天时具有32％和44％的抑制。 来那替尼对表达低水平HER-2和EGFR的MCF-7和MX-1异种移植物几乎没有活性，在80mg / kg /天时仅有28％的抑制，表明来那替尼对表达HER-2或EGFR的细胞具有选择性活性。[1]。

二、来那替尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
将细胞暴露于各种浓度的来那替尼 2或6天。 使用磺酰罗丹明B（蛋白质结合染料）测定细胞增殖。 简言之，将细胞用10％三氯乙酸固定并用水充分洗涤。 然后将细胞用0.1％磺酰罗丹明B染色并在5％乙酸中洗涤。 将蛋白质相关染料溶解于10mM Tris中，并在450nM下测量吸光度。 从抑制曲线确定抑制细胞增殖50％的来那替尼浓度（IC 50）。

2）动物实验
将肿瘤细胞（维持在组织培养物中）或肿瘤碎片植入皮下。在雌性无胸腺（裸）小鼠的侧腹。对于雌激素依赖性细胞系（BT474，MCF-7和SK-OV-3），在植入肿瘤前1周，给动物植入激素颗粒（0.72mg 17-β雌二醇，60天释放）。另外，将SK-OV-3细胞悬浮在Matrigel基底膜基质中用于植入。在将动物随机分配到不同治疗组（分期，第0天）后，在肿瘤达到90-200mg的大小后开始治疗。对于3T3 / neu异种移植物，在肿瘤植入后第二天（第0天）开始治疗。将HKI-272配制在0.5％甲基纤维素-0.4％聚山梨醇酯-80（吐温80）中，并通过管饲法每天口服给药。每7天测定肿瘤质量[（长度×宽度2）/ 2]。除3T3 / neu外，所有异种移植研究中的肿瘤生长表示为相对肿瘤生长：第0天平均肿瘤质量与平均肿瘤质量的比率。相对于载体处理的对照计算肿瘤生长的抑制。在数据的对数转换后使用单尾学生t检验（等方差）证明抑制的统计显着性。

3）激酶实验
将来那替尼制备成DMSO中的10mg / mL储液，并在25mM HEPES（pH7.5; 0.002ng / mL-20μg/ mL）中稀释。 HER2（氨基酸676-1255）或表皮生长因子受体（EGFR）（氨基酸645-1186）的纯化重组COOH-末端片段[在100mM HEPES（pH 7.5）和50％甘油中稀释]以增加的浓度温育将来那替尼在4mM HEPES（pH7.5），0.4mMMnCl2,20μM钒酸钠和0.2mM DTT中在室温下在96孔ELISA板中保持15分钟。通过加入40μMATP和20mM MgCl 2引发激酶反应，并使其在室温下进行1小时。洗涤平板，并使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体（15ng /孔）检测磷酸化。在洗涤和增强步骤后，使用Victor2荧光读数器（激发波长340nm，发射波长615nm）检测信号。从抑制曲线计算抑制受体磷酸化50％的来那替尼浓度（IC 50）。

综上所述：来那替尼是一种可口服的，不可逆的 tyrosine kinase 抑制剂，能够抑制 HER2 和 EGFR 的活性，IC50 值分别为 59 nM 和 92 nM。它的靶点活性为EGFR,92nM；HER2,59nM；PDK1,>5μM；Src,1.4μM；VEGFR2 (KDR),800nM。

参考文献：
[1]. Rabindran SK, et al. Antitumor activity of HKI-272, an orally active, irreversible inhibitor of the HER-2 tyrosine kinase. Cancer Res, 2004, 64(11), 3958-3965.
[2]. Yoshioka T, et al. Antitumor activity of pan-HER inhibitors in HER2-positive gastric cancer. Cancer Sci. 2018 Apr;109(4):1166-1176.