KI696

KI696是一种干扰 Keap1/NRF2 相互作用的高亲和力探针。

信号通路 >> NF-κB信号通路 >> KEAP1-Nrf2

研究领域 >> 炎症/免疫

研究领域 >> 代谢疾病

Target: Keap1-NRF2[1]

KI696(化合物7)对KEAP1 Kelch结构域表现出非常高的亲和力(ITC Kd = 1.3 nM,有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)除外(IC50 =2.5μM),胆盐输出泵BSEP(IC50 = 4.0) μM)和磷酸二酯酶PDE3A(IC50 =10μM),没有观察到显着的交叉反应性。在浓度高达10μM的情况下,KI696对BEAS-2B细胞没有观察到细胞毒性.KI696增加正常人支气管上皮细胞的NRF2核转位KI696增加转染非靶向siRNA的NHBE细胞中NRF2依赖性基因NQO1和GCLM的mRNA表达,而NRF2基因沉默显着降低化合物活性.KI696以NRF2依赖性方式增加NQO1活性。用tBHP明显治疗对细胞健康和外观有不利影响,同时在暴露于tBHP之前用1μMCI696预处理细胞,维持细胞形态与DMSO对照一致.KI696诱导Exp NRF2调节基因在COPD患者来源的支气管上皮细胞中的应用[1]。

KI696以剂量依赖性方式诱导Nqo1,Ho-1,Txnrd1,Srxn1,Gsta3,Gclc基因中的每一个的表达,与37-(Nqo1),17-(Ho-1)的载体对照相比最大增加,在50μmol/ kg剂量下发生9-(Txnrd1),28-(Srxn1),15-(Gsta3)和13-倍(Gclc)。 EC50值分别为44.0,25.7,42.6,33.8,28.4和44.1μmol/ kg,平均EC50值为36.4±3.4μmol/ kg。 KI696减弱臭氧诱导的肺部炎症。 KI696恢复臭氧诱导的肺GSH水平的消耗。通过静脉输注给予大鼠10,35和50μmol/ kg的KI696,在6小时输注中,血液中的稳态化合物浓度分别为407±44nM,946±50nM和1437±186nM。期。在给药后24小时暴露于臭氧导致抗氧化剂分子GSH的肺水平显着减少,其由KI696以剂量依赖性方式恢复[1]。

使用基于荧光偏振的竞争测定法在黑色384孔微孔板中测定对Kelch结构域-NRF2相互作用的抑制。每孔含有2 nM 5'-TAMRA-NRF2肽（AFFAQLQLDEETGEFL）和7 nM人KEAP1（残基321-609）在50μL测定缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0,100 mM NaCl，5 mM MgCl 2,2中） mM 3 - [（3-氯代丙基）二甲基氨基] -1-丙磺酸酯（CHAPS），1mM DTT，0.005％BSA，1％DMSO）。在室温下1小时后，使用BMG Pherastar FS读板仪测量荧光偏振（激发485nm /发射520nm）。 IC50值通过将数据拟合为四参数逻辑拟合来确定[1]。

将BEAS-2B细胞接种在384孔黑色透明底板中并孵育过夜（37℃，5％CO 2）。在第2天，将板离心，并将50nL化合物（KI696）或对照加入细胞中48小时。在第4天，从平板吸出培养基，通过使用具有Complete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂的1X裂解缓冲液制备粗细胞裂解物。裂解后，将板在室温下温育20分钟，制备MTT混合物用于测量NQO1活性。在Envision读板仪上分析样品，读取570nm处的吸光度，每隔10分钟读取5个单独的读数。通过动力学测量产物形成，并通过绘制吸光度相对于log [化合物]的随后的4参数拟合[1]来计算NQO1比活性诱导的pEC50。

大鼠[1]为了检测KI696在氧化应激条件下的作用，通过IV输注在6小时内给予大鼠35μmol/ kg的KI696（基因表达的大致平均EC50值），并且在24小时后暴露于臭氧（1小时3小时）。在臭氧暴露终止后15分钟，测量支气管肺泡灌洗液（BAL）中的总细胞，中性粒细胞和单核细胞的数量[1]。

[1]. Davies TG, et al. Monoacidic Inhibitors of the Kelch-like ECH-Associated Protein 1: Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 (KEAP1:NRF2) Protein-Protein Interaction with High Cell Potency Identified by Fragment-Based Discovery. J Med Chem. 2016 Apr 28;59(8):3991-4006.

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