帕纳替尼_作用_生物活性_实验方法

发布时间:2018-10-25 14:14:43 编辑作者:活性达人

帕纳替尼图片

图片:帕纳替尼结构式

帕纳替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂,用于治疗费城染色体阳性的难治性慢性粒细胞白血病(CML)。

一、帕纳替尼的生物活性详解:
1)体外活性
帕纳替尼(AP24534)有效抑制天然ABL(IC50:0.37nM),ABLT315I(IC50:2.0nM)和其他临床上重要的ABL激酶结构域突变体(IC50:0.30-0.44nM)。 帕纳替尼还抑制SRC(IC50:5.4nM)和受体酪氨酸激酶的VEGFR,FGFR和PDGFR家族成员。 帕纳替尼有效抑制表达天然BCR-ABL的Ba / F3细胞的增殖(IC50:0.5nM)。所有测试的BCR-ABL突变体对帕纳替尼(IC50:0.5-36 nM)仍然敏感,包括BCR-ABLT315I(IC50:11 nM)[1]。 帕纳替尼(AP24534)抑制FLT3,KIT,FGFR1和PDGFRα的体外激酶活性,IC50值分别为13,13,2和1nM。 帕纳替尼以剂量依赖性方式抑制所有4种RTK的磷酸化,IC5​​0值在0.3至20nM之间。与这些激活的受体一致,在驱动白血病发生中,帕纳替尼也有效地抑制所有4种细胞系的生存力,IC50值为0.5至17nM。相反,抑制RS4的IC50;表达天然(未突变的)FLT3的11个细胞超过100nM [2]。

2)体内活性
在其中小鼠注射Ba / F3 BCR-ABLT315I细胞的存活模型中,以高达300mg / kg的剂量施用达沙替尼对存活时间没有影响。相比之下,使用帕纳替尼(AP24534)治疗可以剂量依赖的方式延长生存期。 帕纳替尼以5,15和25mg / kg口服给药19天,将中位存活时间延长至19.5,26和30天,分别比载体处理小鼠的16天(所有三个剂量水平p <0.01)。在异种移植模型中进一步评估帕纳替尼(AP24534)的抗肿瘤活性,其中将Ba / F3 BCR-ABLT315I细胞皮下注射到小鼠中。与媒介物处理的小鼠相比,帕纳替尼以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长,在每日口服10和30mg / kg时显着抑制肿瘤生长(%T / C = 68%和20%;两种剂量水平均p <0.01)。每日口服50mg / kg 帕纳替尼导致显着的肿瘤消退(%T / C = 0.9%,p <0.01),与治疗开始时相比,最终测量的平均肿瘤体积减少96%。在研究期间,帕纳替尼在所有有效剂量水平下都具有良好的耐受性;对于10,30和50mg / kg剂量组,体重的最大降低分别<5%,<5%和<12%,没有明显毒性的迹象[1]。将帕纳替尼(1-25mg / kg)口服给药,每天一次,持续28天,给予携带MV4-11异种移植物的小鼠。 帕纳替尼以剂量依赖性方式有效抑制肿瘤生长。施用1mg / kg(测试的最低剂量)导致肿瘤生长的显着抑制(TGI = 46%,P <0.01),并且2.5mg / kg或更大剂量导致肿瘤消退[2]。

二、帕纳替尼的实验方法:
1)动物实验
小鼠[1]-对于Ba / F3存活模型,将表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba / F3细胞注射到雌性SCID小鼠的尾静脉中(100μL在无血清培养基中的1×10 7个细胞/ mL悬浮液)。开始72小时后,通过用载体(25mM柠檬酸盐缓冲液,pH 2.75),帕纳替尼或达沙替尼口服管饲法每天一次处理小鼠,连续19天。根据IACUC指南牺牲濒死动物。在尸检时,由于肿瘤细胞浸润,小鼠有明显的脾肿大。使用Kaplan-Meier方法分析存活数据,并且使用Log-rank测试评估统计显着性,比较每个治疗组与媒介物组的存活时间。对于Ba / F3肿瘤模型,将Ba / F3 BCR-ABLT315I细胞皮下植入雌性裸鼠的右胁腹(100μL在无血清培养基中的1×10 7个细胞/ mL细胞悬浮液)。当平均肿瘤体积达到约500mm 3时,将小鼠随机分配至治疗组。用载体(25mM柠檬酸盐缓冲液,pH 2.75)或帕纳替尼口服管饲法每天一次处理小鼠,连续19天。计算肿瘤体积(mm 3)。为了在治疗期结束时确定肿瘤生长抑制,在最终测量时计算治疗组的平均肿瘤体积/对照组的平均肿瘤体积(%T / C)。

2)细胞实验
将Ba / F3细胞系分布在96孔板(4×103细胞/孔)中,并与升高浓度的帕纳替尼孵育72小时。 使用的抑制剂范围是:对于表达BCR-ABL的细胞为0-625nM,对于BCR-ABL阴性细胞为0-10,000nM。 使用基于甲硫基磺酸盐(MTS)的活力测定法测量增殖。 IC50值报告为一式四份进行的三次独立实验的平均值。 对于使用CML或正常原代细胞的细胞增殖实验,将单核细胞接种于96孔板(5×104细胞/孔)中,在梯度浓度的帕纳替尼(0-1000nM)中,在补充有10%FBS,L-谷氨酰胺的RPMI中 ,青霉素/链霉素和100μMβ-巯基乙醇。 孵育72小时后,通过对细胞进行MTS测定来评估细胞活力[1]。

3)激酶实验
具有GST-Abl激酶结构域的肽底物磷酸化测定:通过使用合成肽底物(Abltide:EAIYAAPFAKKK)评估AP24534(0-320nM)对GST-Abl激酶活性的影响。在25μL反应混合物中在30℃下进行测定15分钟:8mM MOPS(pH 7),0.2mM EDTA,50μMAbltide,30mM MgCl2,10mMβ-甘油磷酸酯,1mM EGTA,0.002% Brij-35,0.4mM DTT,0.2mg / mL BSA,0.4mM原钒酸钠,10nM WT或突变体GST-Abl激酶,和100μMATP/γ-32 [P] ATP(5000cpm / pmol)。通过将一部分反应混合物转移到p81磷酸纤维素滤膜上并浸入0.75%磷酸中终止反应。将过滤器在0.75%磷酸中洗涤3次,在丙酮中漂洗,并风干;通过闪烁计数确定磷酸盐掺入。通过从激酶反应中省略肽底物来确定所有结果的背景与滤膜的结合。在激酶测定之前建立酶活性线性范围的时程实验。

综上所述:帕纳替尼是一种口服有效的多靶点激酶抑制剂,作用于 Abl,PDGFRα,VEGFR2,FGFR1 和 Src,IC50 分别为 0.37 nM,1.1 nM,1.5 nM,2.2 nM 和 5.4 nM。它的靶点活性为Abl,0.37nM;c-Kit,12.5nM;c-Src,5.4nM;FGFR1,2.2nM;PDGFRα,1.1nM;VEGFR2,1.5nM。

参考文献:
[1]. O'Hare T, et al. AP24534, a pan-BCR-ABL inhibitor for chronic myeloid leukemia, potently inhibits the T315I mutant and overcomes mutation-based resistance. Cancer Cell, 2009, 16(5), 401-412.
[2]. Gozgit JM, et al. Potent activity of ponatinib (AP24534) in models of FLT3-driven acute myeloid leukemia and other hematologic malignancies. Mol Cancer Ther, 2011, 10(6), 1028-1035.
[3]. Uchida T, et al. Hes1 upregulation contributes to the development of FIP1L1-PDGRA-positive leukemia in blast crisis. Exp Hematol. 2014 May;42(5):369-379.e3.

相关化合物:帕纳替尼

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