3,3′-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐（CAS 38285-78-8）为同双功能交联剂，两端为亚氨酸甲酯基团，中央为一个二硫键。亚氨酸甲酯可在中性至弱碱性条件下与伯胺形成稳定的脒键，二硫键则提供可逆转化的断裂位点。要断开这个二硫键，需依据不同还原剂的电荷状态、亲核能力和反应平衡选择工艺参数。
一、二硫键所处的化学环境
该化合物游离碱为CH₃O–C(=NH)–CH₂CH₂–S–S–CH₂CH₂–C(=NH)–OCH₃，二盐酸盐分子式为C₈H₁₈Cl₂N₂O₂S₂。两个亚氨甲氧基片段通过亚乙基与二硫键相连，两侧均为伯碳结构，无羰基或芳环共轭，不表现特殊稳定化。因此该二硫键属于普通脂肪族二硫键，常规还原剂在毫摩尔浓度下即可将其切断。
二、硫醇类还原剂作用的条件
1. DTT
DTT（二硫苏糖醇）的还原过程包含两次硫醇盐亲核进攻。第一个巯基负离子攻击二硫键，形成混合二硫化物；同一分子内第二个巯基立即进攻该混合二硫键，释放出原本两个硫醇片段，同时DTT自身氧化为分子内二硫键六元环。由于环状氧化产物热力学稳定，该反应正向进行完全且不可逆，因此不需要极高过量。
对该化合物，选用终浓度为20～50 mM的DTT工作液，缓冲液为不含伯胺的磷酸盐缓冲液，pH调至8.0。将样品溶解后于37°C反应30分钟即可定量还原。若在室温进行，需将时间延长至60分钟。DTT浓度超过100 mM时，亲核副反应增加，不推荐使用。还原产物含有游离巯基，在空气中会重新氧化，因此还原后应立即封闭或置于惰性气氛中。
2. β-巯基乙醇
β-巯基乙醇为单硫醇，一个分子只能亲核进攻一个硫原子，形成的混合二硫化物必须依靠第二分子β-巯基乙醇夺取，才能完成还原。因此有效浓度须比DTT高约一个数量级。还原该化合物二硫键时，采用体积分数5%～10%的β-巯基乙醇，缓冲液pH 7.5～8.5，室温反应2小时，或37°C反应45分钟。氧化副产物为2-羟乙基二硫化物，结构为HOCH₂CH₂S–SCH₂CH₂OH。β-巯基乙醇易挥发，溶液需新鲜配制并在密闭条件下使用；反应后可通过脱盐柱去除。
三、膦类还原剂TCEP
TCEP即三(2-羧乙基)膦，分子中不存在游离巯基。还原机理是磷原子上的孤对电子亲核加合到二硫键的一个硫原子上，形成磷硫加成中间体，随后经水分子分解，产生氧化膦和两个硫醇产物，总反应如下：
R′–S–S–R″ + P(CH₂CH₂COOH)₃ + H₂O → R′SH + R″SH + O=P(CH₂CH₂COOH)₃
TCEP在pH 2～9范围内均能发挥作用，但在该化合物应用中应避免过强碱性导致亚氨酸甲酯水解。推荐条件为TCEP终浓度5～20 mM，pH 7.0～7.5，室温反应10～20分钟。TCEP不生成含硫副产物，不会与还原后的产物硫醇发生重复交换，因此游离巯基浓度稳定。还原结束后无需专门去除TCEP，也不干扰后续碘乙酰胺烷化反应。
四、缓冲液与副反应控制
亚氨酸甲酯基团属于亲电体，在碱性环境中会与伯胺反应形成脒键。因此直接还原该化合物时，缓冲体系严禁使用含伯胺的Tris、甘氨酸等组分，推荐使用磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液。pH应控制在中性至弱碱性范围内，既保证硫醇类还原剂去质子化，又避免亚氨酸甲酯快速水解。pH高于9时亚氨酸甲酯水解显著加快，pH低于7时巯基负离子浓度不足，还原速率下降。适宜pH区间为7.5～8.5。
对于已经利用该化合物完成蛋白交联的体系，亚氨酸甲酯端基已与蛋白质伯胺反应生成脒键，未反应的端基也被淬灭。此时使用50 mM DTT或10 mM TCEP溶于pH 7.5磷酸盐缓冲液，室温处理30分钟，即可切开二硫键，使交联蛋白完整解离。脒键在该还原条件下稳定，不发生断裂。
还原后的产物含有游离巯基，在含氧缓冲液中会重新氧化为二硫键。处理时需要将样品置于氮气气氛中，或者在还原后立即加入碘乙酰胺，其终浓度至少为巯基摩尔数的5倍，进行不可逆烷基化，以锁定还原状态。
DTT适合快速且定量的还原操作；β-巯基乙醇适合低成本、大体积反应；TCEP适合还原后需保持无硫醇环境或需与巯基标记衔接的工艺。该化合物的二硫键在这三类还原剂的规定条件下均可完全断开。