邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，简称ONPG），CAS号为2816-24-2，是一种合成糖苷化合物。它由β-D-吡喃葡萄糖与邻硝基苯酚通过β-糖苷键连接而成，分子式为C12H15NO8，分子量约为301.25 g/mol。该化合物的结构特征在于硝基苯环与葡萄糖单元的连接，这种设计使其在生化反应中具有独特的光学和化学活性。
从化学角度来看，ONPG属于芳基糖苷类化合物，其稳定性较高，在中性或酸性条件下不易水解，但在特定酶催化下可快速发生水解反应。该化合物的合成通常通过苯基糖苷的硝基化或直接糖基化反应制备，在实验室中常作为标准试剂使用。它的纯度要求较高，通常以结晶粉末形式供应，溶解度在水中约为10 mg/mL，在缓冲液中易于配制。
主要用途：β-葡糖苷酶活性测定底物
ONPG的最主要用途是作为β-葡糖苷酶（β-glucosidase）的专用色谱底物，在酶学和生化分析中广泛应用。β-葡糖苷酶是一种水解酶，能够特异性地切割β-糖苷键，将ONPG水解为葡萄糖和邻硝基苯酚（o-nitrophenol）。这一反应是酶促水解的经典模型，反应产物的邻硝基苯酚在碱性条件下（pH > 8）呈现黄色，可通过分光光度计在405 nm波长下定量检测。
反应机理
反应过程可简述为：
底物识别：β-葡糖苷酶的活性位点与ONPG的β-糖苷键精确匹配，利用酶的酸-碱催化机制（如谷氨酸或天冬氨酸残基）激活水分子。
水解步骤：酶催化的亲核攻击导致糖苷键断裂，释放自由的邻硝基苯酚和葡萄糖。邻硝基苯酚的硝基基团增强了其酸性，使其易于去质子化形成酚盐离子，产生明显的颜色变化。
定量分析：产物吸收峰的强度与酶活性成正比。根据米氏方程（Michaelis-Menten kinetics），可计算酶的Km值（Michaelis常数）和Vmax（最大反应速率）。典型Km值为0.1-1 mM，表明ONPG的亲和力适中，便于实验操作。
这一用途源于20世纪50年代的酶学研究，由Wallerstein公司首次报道，用于细菌和真菌来源的β-葡糖苷酶测定。目前，ONPG已成为国际标准方法（如ISO标准）中酶活性测定的首选底物，尤其在微生物学和植物生理学领域。
实验应用细节
在实际操作中，ONPG实验通常在37°C下进行，使用Z缓冲液（含β-巯基乙醇和异丙基-β-D-半乳糖苷）作为反应体系。反应时间视酶浓度而定，常见为5-30分钟。产物定量后，可计算酶单位（U/mL），其中1 U定义为每分钟释放1 μmol邻硝基苯酚。
例如，在大肠杆菌（E. coli）lacZ基因表达研究中，ONPG用于快速筛选β-半乳糖苷酶（一种功能上类似β-葡糖苷酶的酶）活性。该底物的高灵敏度（检测限可达0.01 U/mL）使其优于其他非色谱底物，如4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（PNPG），后者虽类似但波长稍有差异（400 nm）。
扩展应用领域
除了核心的酶活性测定，ONPG在多个化学和生物相关领域有辅助用途：
1. 微生物鉴定与筛选
在临床微生物学中，ONPG水解试验用于鉴定肠道细菌，如鉴定产气荚膜杆菌或某些乳酸菌。阳性结果（黄色显色）表明菌株表达β-葡糖苷酶，常与API 20E系统结合使用。该方法快速、经济，适用于食品安全和环境监测。
2. 植物和动物组织酶学研究
ONPG常用于提取和纯化植物来源的β-葡糖苷酶，例如从杏仁或柳树皮中分离的酶。这些酶参与木质素降解和次生代谢物水解。在动物模型中，它帮助研究溶菌酶或胃肠道酶的活性，探讨糖尿病或纤维素酶补充剂的功效。
3. 制药与药物开发
在药物筛选中，ONPG作为高通量筛选（HTS）底物，用于评估潜在的酶抑制剂或激活剂。例如，开发治疗莱姆病（由伯氏螺旋体引起）的β-葡糖苷酶抑制剂时，ONPG提供可靠的活性读出。此外，它在生物制药中用于质量控制，确保重组酶的纯度和活性。
4. 教育与教学
作为基础生化实验的经典试剂，ONPG广泛用于大学课程中演示酶动力学。学生可通过变温或抑制剂实验观察Michaelis-Menten曲线，理解酶的底物特异性和抑制机制。
注意事项与局限性
从专业角度，使用ONPG需注意其光敏性和热稳定性，避免强光或高温储存（推荐4°C避光）。反应中可能干扰物包括还原糖或金属离子，可通过添加EDTA缓解。虽毒性低（LD50 > 5000 mg/kg），但硝基化合物可能致敏，操作时需戴手套。
与PNPG相比，ONPG的颜色更稳定，但pH依赖性强，要求严格控制反应终止液的碱度。近年来，荧光底物如4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷开始替代，但ONPG因成本低（约0.1-0.5 USD/mg）和易得性，仍是主流选择。
总之，邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的核心价值在于其作为酶学工具的精确性和可靠性，推动了从基础研究到工业应用的诸多进展。