4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（CAS号：3459-18-5），简称pNP-GlcNAc，是糖化学和酶学研究中常用的合成中间体和酶底物。该化合物以β-D-吡喃葡萄糖苷形式存在，2位氨基被乙酰保护，4-硝基苯基作为离去基团，便于在酶促反应中监测通过p-硝基苯酚的释放（吸收峰在405 nm）。它常用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（HexNAcase）的活性测定、糖基转移酶的底物筛选，以及糖链合成。在设计实验协议时，需要考虑化合物的稳定性（易受酸碱影响）、纯度要求（>95%用于酶学实验）和安全操作（硝基化合物具有潜在毒性）。以下协议聚焦于其典型合成路径，基于Koenigs-Knorr法或酶法变体，适用于实验室规模制备（产量约1-5 g）。
实验目的与原理
实验目标：通过化学合成或酶促偶联制备高纯度pNP-GlcNAc，用于下游生物化学应用。原理基于糖苷键的形成：葡萄糖苷供体（如乙酰保护的葡萄糖溴代物）与4-硝基苯酰胺或4-硝基苯醇在碱性条件下反应。合成路线简要如下：
- 起始物：2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（GlcNAc）和4-硝基苯酰氯。
- 关键步骤：保护基团引入、糖苷键偶联、去保护。
预计产率：60-80%。实验时间：3-5天。设备需求：旋转蒸发仪、柱色谱系统、NMR/质谱仪（表征用）。
所需材料与试剂
主要试剂（实验室级，分析纯）
- 2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（GlcNAc，5 g，Sigma-Aldrich）。
- 4-硝基苯酰氯（2.5 g，Alfa Aesar）。
- 溴化银（AgBr，1 g，自制或购得）。
- 无水二氯甲烷（DCM，500 mL）。
- 吡啶（50 mL，作为碱）。
- 乙酸酐（20 mL，用于保护）。
- 甲醇（MeOH，200 mL，去保护用）。
- 硅胶（200-300目，用于柱色谱）。
- TLC板（硅胶GF254，监测反应）。
仪器与耗材
- 磁力搅拌器、冰浴、真空干燥箱。
- pH计、UV分光光度计（纯度检测）。
- 玻璃器皿：圆底烧瓶（100 mL）、分液漏斗、索氏提取器。
所有试剂需在干燥氮气氛围下操作，以防GlcNAc的水解。硝基化合物操作时戴手套，避免皮肤接触。
实验步骤
步骤1：GlcNAc的全乙酰保护（保护基引入，2-3小时）
- 在冰浴中，将5 g GlcNAc溶于50 mL无水吡啶中，搅拌至澄清（约30 min）。
- 缓慢滴加20 mL乙酸酐，室温搅拌2小时。反应监测：TLC（氯仿:甲醇=9:1，Rf≈0.6）。
- 反应结束后，倒入冰水（200 mL）中，用DCM（3×50 mL）萃取。合并有机相，用饱和NaHCO3洗涤（中和酸），再用饱和NaCl洗涤。
- 无水Na2SO4干燥有机相，旋转蒸发浓缩。粗产物经乙醇重结晶，得1,3,4,6-四-O-乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（产物A，产率≈90%，白色固体）。
注意：此步确保氨基和羟基保护，避免副反应。产物A的熔点约130-132°C，可用IR确认（C=O伸缩峰1730 cm⁻¹）。
步骤2：溴代反应生成糖苷供体（1-2小时）
- 将产物A（4 g）溶于50 mL无水DCM中，加入1 g AgBr和0.5 mL HBr（48%水溶液）。
- 室温搅拌1小时，避光操作（银盐光敏）。TLC监测（己烷:乙酸乙酯=1:1，Rf≈0.7）。
- 过滤除去AgBr沉淀，用DCM洗涤滤饼。合并滤液，旋转蒸发，得2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖溴（产物B，粗品，直接用于下一步，产率≈85%）。
专业提示：溴代是Koenigs-Knorr法的核心，生成α-溴糖苷供体，便于后续β-糖苷选择性形成。避免过量HBr，以防脱乙酰。
步骤3：糖苷键偶联（与4-硝基苯酰胺反应，4-6小时）
- 制备4-硝基苯酰胺：将2.5 g 4-硝基苯酰氯溶于20 mL吡啶中，加入氨水（28%，适量），搅拌30 min，得4-硝基苯酰胺（中间体C）。
- 将产物B（3.5 g）与中间体C（2 g）在50 mL无水DCM中混合，加入2 g分子筛（4Å，干燥）和0.5 g Hg(CN)2作为催化剂。
- 在氮气保护下，室温搅拌4小时。TLC监测（氯仿:MeOH=95:5，目标Rf≈0.5）。
- 反应终止后，过滤分子筛，用DCM洗涤。合并有机相，用饱和NaHCO3和NaCl洗涤，干燥后蒸发浓缩。
变体：若采用酶法，可用β-糖苷酶在缓冲液（pH 5.0，醋酸盐）中催化GlcNAc与4-硝基苯酚的偶联，温度37°C，产率更高但需纯化酶。
步骤4：去保护与纯化（ overnight + 2小时）
- 将粗产物溶于100 mL MeOH中，加入催化量NaOMe（0.1 M），室温搅拌 overnight（监测TLC，直至Rf变化）。
- 中和（用AcOH），旋转蒸发，残渣用水溶解，用活性炭脱色。
- 柱色谱纯化：硅胶柱（eluent: 氯仿:MeOH:水=65:35:5），收集目标馏分。旋转蒸发、冻干，得纯pNP-GlcNAc（黄色固体，产率60-80%）。
纯度检查：HPLC（C18柱，流动相MeOH-水，检测波长300 nm），纯度>98%。NMR表征：¹H NMR (DMSO-d6) δ 8.2-8.0 (Ar-H)，5.0 (β-Anomeric H)。
表征与验证
- 功能验证：溶于PBS (pH 7.4，1 mM)，用HexNAcase（1 U/mL）水解，UV监测405 nm吸光度增加，确认酶底物活性。
- 储存：-20°C干燥保存，避免光照和潮湿，有效期>1年。
安全与注意事项
- 风险评估：硝基化合物可能致敏，操作在通风橱中。银/汞盐有毒，废液需专业处理（符合环保法规）。
- 优化建议：初次实验从小规模（0.5 g）开始。若产率低，检查水分含量（Karl Fischer法）。酶法变体适用于绿色合成，减少有机溶剂。
此协议基于标准糖化学文献（如Carbohydr. Res.期刊），可根据具体需求调整。在使用前应验证本地法规，并记录所有参数以确保可重复性。