| 体外研究 |
指南(以下是我们推荐的方案。该方案仅提供指南,应根据您的具体需要进行修改)。A、 酶分析[1]：1.将一等分磷脂置于1×1-cm荧光比色皿中,并将缓冲液(50 mM Tris,pH 8,100 mM NaCl,1 mM CaCl2)添加到总体积为1.3 mL的溶液中。让温度在35°C下平衡,搅拌几分钟,并记录背景发射(背景速率无法检测到)。添加酶(1-10μL)并记录排放。2.将一等分磷脂(78μL 0.05 mM底物/0.5 mM DTPM)置于1×1-cm荧光试管中,并将缓冲液(50 mM Tris,pH 8,100 mM NaCl,1 mM CaCl2,30%甘油)添加到总体积为1.3 mL的溶液中。让温度在35°C下平衡,搅拌几分钟,并记录背景发射(背景速率无法检测到)。将酶(1-10μL)与粘性溶液额外混合,并记录排放量。3.向磷脂基质溶液中添加测量量的BODIPYFL-C5(对于PBPEC6DNP和MBPEDNP)或BODIPY-FL-C5-lyso-PAF(对于BC11-DNPC8-PC),并记录排放量的增加。然后使用BODIPY产品/强度单位增加的皮摩尔因子,将分析中的排放增加/秒转换为产品/秒的皮摩尔。B、 斑马鱼体外试验[1]：1.将胚胎置于0.15 mL胚胎培养基中(EM:13.7 mM NaCl,0.537 mM KCl,0.025 mM Na2HPO4,0.044 mM KH2PO4,1.30 mM CaCl2,1 mM MgSO4,4.2 mM NaHCO3,pH 7.2)。2.含有150-200 ng荧光磷脂底物,并超声2-5 s。3.在37℃下1 h后,通过添加0.45 mL氯仿：甲醇(2:1),停止反应,混合,并离心(30 s,16000g)。4.丢弃水部分,并将一份有机部分加载到薄层色谱板上。5.在甲苯：乙醚：乙醇：乙酸(50:40:2:0.2)中制备板,并使用激光扫描仪定量。
|
