| 描述 |
GSK484 是一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶 4 (PAD4) 抑制剂。GSK484 高亲和力与 PAD4 结合,在不存在钙的情况下 IC50 为 50 nM。在 2 mM 钙的存在下,IC50 为 250 nM。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
IC50: 50 nM (PAD4, in the absence of Calcium), 250 nM (PAD4, in the presence of 2 mM Calcium)[1]
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| 体外研究 |
GSK484表现出与低钙形式的PAD4的高亲和力结合,在不存在钙(0mM)和钙(2mM)的情况下IC50分别为50nM和250nM。 GSK484还以浓度依赖性方式抑制PAD4瓜氨酸化(在0.2mM钙)苯甲酰-精氨酸乙酯(BAEE)底物,如使用NH3释放测定法检测的[1]。
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| 体内研究 |
为了解决PAD4抑制是否可以抑制癌症相关的肾损伤,用每天4mg/kg的PAD4抑制剂GSK484处理MMTV-PyMT小鼠一周。该剂量抑制癌症小鼠外周血中发生NETosis的嗜中性粒细胞数量增加。同时,与未治疗的荷瘤小鼠相比,来自MMTV-PyMT小鼠的尿液中的总蛋白质水平显着降低,进一步支持GSK484处理后肾脏功能状态的改善。在一周内每天以4mg/kg的剂量施用GSK484在肿瘤小鼠中恢复肾功能障碍的迹象与DNase I治疗的程度相同,没有任何可检测的毒性迹象[2]。
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| 激酶实验 |
在不同浓度的钙（0,0.2,2和2）下，在10nM GSK215存在下，在测定缓冲液（100mM HEPES，pH8,50mM NaCl，5％甘油，1mM CHAPS，1mM DTT）中连续稀释PAD4。 10mM）。孵育50分钟后，使用单一位点饱和曲线确定每种钙浓度的表观Kds。对于IC50测定，将测试化合物（例如，GSK484）在DMSO中连续稀释（1％最终测定浓度）并在PAD4存在下在相同范围的钙浓度下测试（在每种钙条件下计算的Kd）和10nM GSK215在相同的测定缓冲液和体积中。将反应温育50分钟，之后使用四参数逻辑方程[1]计算IC 50值。
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| 细胞实验 |
通过逆转录病毒转导工程改造稳定表达N末端FLAG标记的PAD1，PAD2，PAD3或PAD4的HEK293细胞。使细胞在15cm直径的平板中生长至在补充有10％胎牛血清的DMEM中的亚汇合，通过离心收获并在PBS / 2mM EGTA中洗涤一次。将细胞在50mM Tris-Cl，pH7.4,1.5mM MgCl 2,5％甘油，150mM NaCl，25mM NaF，1mM Na 3 VO 4,0.4％NP40,1mM DTT和蛋白酶抑制剂中裂解。将裂解物在4℃下与仅DMSO（2％），100μMGSK199，GSK484，GSK106或200μMCl-脒预孵育20分钟。瓜氨酸化反应在37℃，2mM钙存在下进行30分钟。将提取物加载到凝胶上，通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。然后使用抗修饰的瓜氨酸抗体对瓜氨酸化蛋白质进行化学修饰和检测。使用抗FLAG抗体[1]检测FLAG-PAD构建体。
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| 动物实验 |
小鼠[2]该研究包括两个转基因小鼠模型，用于乳腺癌的MMTV-PyMT小鼠模型（FVB / n背景）和用于胰腺神经内分泌癌的RIP1-Tag2小鼠模型（C57BL / 6背景）。每天通过腹膜内注射PAD4抑制剂GSK484（4mg / kg）治疗小鼠。将GSK484以25mg / mL的浓度溶解于99.9％乙醇中以产生储备溶液，并在注射200μL/小鼠前不久在0.9％NaCl中进一步稀释1:50 [2]。
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| 参考文献 |
[1]. Lewis HD, et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 2015 Mar;11(3):189-91. [2]. Cedervall J, et al. Pharmacological targeting of peptidylarginine deiminase 4 prevents cancer-associated kidney injury in mice. Oncoimmunology. 2017 Apr 20;6(8):e1320009.
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